苦蘵查爾酮合成酶編碼基因(PaCHS1)的克隆及表達譜分析

朱宇佳，郭 宏，孫 濤，盧江杰，馮尚國，展曉日，應奇才，孟一君，沈晨佳，王慧中

(杭州師范大學生命與環境科學學院 浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室，浙江 杭州 310036)

類黃酮在植物體內具有重要生物學意義，已知它們有著控制生長素的運輸、根系發育及向地性、種子萌發、植物與共生微生物的信號互作、紫外保護、抵御外來生物等作用[1]。類黃酮化合物中的花青素和花青素原是植物花、果實和種子色素的主要成分，其含量及成分的變化易于觀察。同時，花青素和花青素原合成途徑已成為研究植物次生代謝基因表達及調控的模式途徑[2]。在高等植物中，類黃酮類物質是廣泛存在的次生代謝物，在植物與環境的相互作用中起到了重要作用[3]。

查爾酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黃酮類物質代謝合成途徑中的關鍵酶，它催化了該途徑的第一步,即1分子的香豆酰CoA(coumaryl-CoA)與3分子的丙酚CoA (malonyl-CoA)生成4，5，7-三羥基黃烷酮(naringenin chalcone)，該產物進一步衍生轉化構成了各類黃酮化合物，進而作為多種黃酮類化合物的前體參與下游次生代謝產物的最終形成[4]。查爾酮合成酶是CHS超基因家族的核心酶,該超基因家族還包括一系列通過基因復制和功能分化衍生出的類CHS(CHS-like)蛋白[5]。從功能角度來看,查爾酮合成酶超基因家族的所有成員均屬于生物聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)中結構最簡單的類型[6-7]。查爾酮合成酶超基因家族成員之間均具有高水平的序列同源性,在結構和催化機制上也具有極大的相似性，均是由40～45 ku亞基構成的同型二聚體,并且在活化位點處均含有由3個保守氨基酸Cys-His-Asn構成的三聯體活性中心結構[8-9]。

苦蘵(PhysalisangulataL.)，為茄科(Solanaceae)酸漿屬(Physalis)一年生草本植物，廣泛分布于海拔500～1 500 m的我國南方地區。作為一種有著悠久歷史的藥用植物，許多中藥地方志都對苦蘵的藥用性狀及價值有著詳細的描述[10]。現代醫學最新研究表明，苦蘵主要化學成分為醉茄內酯、酸漿苦素、黃酮、多種酯的甙化合物、生物堿及甾醇等[11]。在苦蘵葉片的提取物中，分離得到一種黃酮苷類化合物myricetin 3-O-neohesperidoside，被證實是一種新的具有細胞毒性的黃酮類化合物[12]。此外，苦蘵中也分離出多種其他黃酮類物質，它們作為重要的活性物質，發揮著一系列抗氧化活性的作用[13]。由此可見，黃酮類物質是形成苦蘵藥效的一類重要物質。已有研究表明，CHS是植物黃酮、異黃酮類物質合成的限速酶[14]。通過對苦蘵CHS 基因的研究，有助于進一步了解CHS 酶的催化機理，為進一步豐富和完善苦蘵類黃酮合成代謝途徑研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦蘵材料取自浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室的溫室大棚中，大腸埃希菌取自本實驗室保存菌種DH5α；超表達載體pDL28-DHA，克隆載體pMD19-T采購自TaKaRa公司。

1.2 化學試劑

酵母提取物、蛋白胨、氯化鈉、Agar、牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、蔗糖、硫酸鎂、Amp、Kan、X-Gal、IPTG、液氮、三氯甲烷、異丙醇、20×TBE緩沖液、DNA Marker(Trans2000)等。TaKaRa公司T4 DNA連接酶、T緩沖液10×、BSA(10×)、KpnⅠ、SalⅠ、PrimeSTAR Max DNA PolymerasePCR、 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、pMDTM19-T Vector Cloning Kit，康為世紀的高純度質粒小提試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、Trizol。

1.3 苦蘵RNA提取以及cDNA模板的合成

取苦蘵果實，使用Trizol法提取總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測RNA質量和濃度。把合格的RNA合成第一鏈cDNA，采用的是康為世紀的HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒。根據反應體系，加入到PCR管中。輕輕振蕩混勻，短暫離心防止管壁上殘留溶液。42 ℃孵育40 min，85 ℃孵育5 min。冰置冷卻后，-20 ℃保存。用苦蘵Actin引物(表1)PCR擴增cDNA，PCR反應條件：94 ℃ 5 min; 98 ℃ 30 s; 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個循環; 72 ℃ 10 min。并用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測得到的cDNA質量。

表1 引物名稱及相關引物序列

1.4 PCR擴增目的基因

我們從中選取了CHS家族基因PaCHS1和PaCHS2，基于其全長序列，設計相應引物，并在引物末端添加KpnⅠ、BamHⅠ酶切識別位點，引物交由生工生物工程股份有限公司合成(表1)。目的基因擴增使用TaKaRa的PrimeSTAR Max DNA Polymerase PCR，20 μL反應體系。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，32個循環；72 ℃ 10 min。PCR結束后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并將PCR產物回收。在PCR產物3’端添加dA堿基，將平末端處理為黏性末端。按操作手冊將試劑加好后在72 ℃下處理15 min，再進行電泳，并且瓊脂糖回收。目的片段的純化回收采用的是TaKaRa公司的膠回收試劑盒：MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0。把純化的目的片段與T載體連接，連接使用的是TaKaRa的pMDTM19-T Vector Cloning Kit。按操作手冊中的反應體系加好后16 ℃反應30 min。

1.5 重組質粒的提取，質粒的鑒定及測序

采用康為世紀的高純度質粒提取試劑盒提取重組質粒。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒長度。將提取的質粒37 ℃雙酶切2 h，然后電泳驗證酶切條帶，雙酶切體系試劑用量:質粒5 μL，T緩沖液10×3 μL，BSA(10×) 2 μL，KpnⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O加到20 μL。將正確的菌液送到測序公司進行測序分析(上海桑尼生物技術有限公司)。

1.6 苦蘵查爾酮合成酶蛋白的生物信息學分析

利用ExPASy Proteomics Server上的在線工具Protparam(http://web.expasy.org/protparam/) 對PaCHS1/2基因編碼蛋白的理化性質進行分析預測；采用SOMPA(http://www.expasy.ch/tools)和Phyre2在線軟件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/) 分別對PaCHS1/2基因編碼蛋白進行二級結構分析與3D結構建模； SignalP4.0 Server ((http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進行分泌蛋白預測；利用在線軟件ProtComp v. 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml) 進行蛋白定位信號預測。PaCHS1/2蛋白氨基酸序列比對利用NCBI的蛋白質序列數據庫進行搜索，并通過ClustalW軟件進行作圖。通過MEGA 6.1 構建Neighbor-joining系統進化樹,bootstrap重復次數為1 000次，其他采用默認設置。

1.7 35S亞細胞定位載體的構建

用相同的限制性內切酶KpnⅠ、BamHⅠ將測序正確的質粒和pCAMBIA1300GFP亞細胞定位載體進行雙酶切37 ℃、6 h。酶切產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并將目的基因片段與GFP1300亞細胞定位空載酶切片段進行切膠回收；將目的片段連接到亞細胞定位載體GFP1300上，使用的是T4 DNA連接酶，將試劑按表格用量加入PCR管中，輕彈混勻并短暫離心，16 ℃過夜。將連接產物轉化到大腸埃希菌感受態，然后在含Kan的LB固體培養基上培養12 h左右。挑選單菌落，將其擴大培養，并進行質粒提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒質量。采用雙酶切法鑒定質粒連接情況，并進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 植物激素處理

采取坐果14 d后的未成熟果實為實驗材料。將果實于10 μmol·L-1濃度生長素、細胞分裂素、水楊酸、脫落酸、茉莉酸乙烯中浸泡3 h。取出，以ddH2O漂洗3遍后，凍于液氮中待用。以未處理的果實為對照。

2 結果與分析

2.1 基于苦蘵轉錄組數據的CHS注釋，序列拼接及克隆

搜索苦蘵轉錄組數據，得到12條與查爾酮合成酶相關的序列。利用上述得到的12條序列進行拼接，得到一條完整的苦蘵CHS編碼基因序列，命名為PaCHS1。針對得到的序列，設計擴增引物。該基因的長度均在1 200 bp左右，最終擴增出與目的基因長度相仿的片段。將擴增出的DNA片段進行切膠回收，TA克隆后送測序公司測序。測序結果與轉錄組測序所得序列相一致。

2.2 苦蘵PaCHS1/2蛋白的理化性質

通過DNAStar軟件，分析得到PaCHS1基因具有一個完整的開放閱讀框(ORF)，共有1 170個堿基。利用在線軟件ProtParam對PaCHS1基因的編碼蛋白的理化性質進行分析，結果表明，PaCHS1基因預測編碼一個含有389個氨基酸的蛋白，該蛋白分子式為C1890H3040N508O562S20，分子質量為42.5 ku，蛋白等電點pI 6.28，帶正電殘基(Arg+Lys)為43個，帶負電殘基(Asp+Glu)為46個，該蛋白的不穩定系數為36.57，脂肪系數為93.47，平均親水性系數為-0.049。

2.3 PaCHS1蛋白的結構比對

利用在線SignalP4.1Server 軟件分析發現，PaCHS1蛋白均不含信號肽。利用在線工具WOLF PSORT分析PaCHS1蛋白的亞細胞定位，預測結果相同：分泌系統小泡定位系數48.0%，質膜定位系數36.0%，細胞骨架定位系數16.0%。利用Phyre2在線軟件進行蛋白3D結構建模，PaCHS1蛋白的保守結構域三維結構模型如圖1所示,結構模型以番茄CHS (Solyc05g053550.2.1)為模板，PsCHS1的211個氨基酸殘基(占整個蛋白的54.2%)與對照模型具有100%的相似度。

2.4 不同植物CHS蛋白序列的比對及進化分析

將克隆得到PaCHS1蛋白序列提交至美國國立信息技術中心(NCBI)的數據庫，進行相似性搜索。從搜索結果中，下載得到了12條與PaCHS1高度同源的蛋白序列。本研究選取的物種包括：甜辣椒(Capsicumannuum， NP_001311934), 番茄(Solanumlycopersicum， NP_001234036.2), 馬鈴薯(Solanumtuberosum，NP_001275296.1), 野茶樹(Camelliasinensis，AGI02994.1), 小金魚草(Misopatesorontium，CAJ44127), 杜鵑花(Rhododendronsimsii，CAC88858), 雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii，XP_012481763.1), 棉花(Gossypiumhirsutum，XP_016747999.1), 矮牽牛(Petuniaxhybrid，BAM17287.1)，烏桕(Triadicasebifera，ARW29605.1), 麻風樹(Jatrophacurcas，NP_001295723.1)和浙江紅山茶(Camelliachekiangoleosa，AFC37242.1)。利用ClustalX2.1軟件，將PaCHS1蛋白序列與下載得到的12條蛋白序列進行序列同源比對，結果表明，上述蛋白具有極高的序列相似度(圖2)。這進一步說明，克隆得到的PaCHS1是苦蘵查爾酮合成酶的編碼基因。

圖1 PaCHS1蛋白的保守結構域三維結構模型

圖2 PaCHS1蛋白序列與下載得到的12條蛋白序列的同源比較

為了分析PaCHS1蛋白與其他物種序列的進化關系，通過MEGA6.1軟件(N-J法)構建不同植物之間CHS蛋白的系統進化樹(圖3)。結果表明，克隆得到的兩個PaCHS1蛋白與1，2下載得到的同源蛋白形成兩個主要的分支：聚類Ⅰ、聚類Ⅱ和聚類Ⅲ。其中，苦蘵PaCHS1屬于聚類Ⅰ和小金魚草的MoCHS1親緣關系最近。

2.5 PaCHS1蛋白的亞細胞定位

利用克隆到的PaCHS1的全長序列，構建35S∶PaCHS1∶GFP載體，通過農桿菌介導，轉入苦蘵葉肉細胞中，通過熒光共聚焦顯微鏡，觀察PaCHS1蛋白的亞細胞定位情況。實驗結果表明，35S∶GFP空載體定位于細胞各處，作為陽性對照。PaCHS1蛋白定位與細胞質和細胞膜中，這與生物信息學分析的結果基本一致。細胞質定位這一點，與PaCHS1蛋白的生物酶功能相一致(圖4)。

圖3 不同植物CHS蛋白系統進化樹

圖4 PaCHS1蛋白的亞細胞定位

2.6 PaCHS1基因的表達模式

實時定量RT-PCR檢測基因在苦蘵的不同組織器官中的表達圖譜。結果表明，PaCHS1基因在各個器官中都有一定的表達，其中在果實中的表達水平最高，在莖中的表達水平最低。此外，在葉片，根和花器官中皆有一定的表達(圖5)。我們又分析了PaCHS1基因在不同激素處理下的表達變化。結果表明，PaCHS1基因的表達水平受到不同激素的調控。PaCHS1受到茉莉酸(JA)的強烈誘導，而受到赤霉素(GA)、乙烯(ethylene)和細胞分裂素(cytokinin)的強烈抑制。有意思的是，PaCHS1的表達水平在茉莉酸的處理下上升超過5倍，這說明PaCHS1和茉莉酸密切相關(圖6)。

圖5 PaCHS1基因在苦蘵不同組織器官中的表達

圖6 PaCHS1基因在不同激素調控下的表達水平

3 討論

苦蘵作為一種歷史悠久的藥用植物，較早地被記載于藥典中。近年來，苦蘵的藥用價值得到了深入的開發，多種活性物質陸續得到了鑒定[15]。最近的研究表明，苦蘵中存在的多種抗癌物質，如酸漿苦素A和B(physalin A 和B)等,都具有體外的抗腫瘤活性[16-17]。隨著科技的進步，更多苦蘵活性物質的功能和藥效也將得到解析。黃酮類物質，作為一種常見代謝物質，廣泛參與植物活性物質的合成。同時，作為其他代謝途徑的前體物，黃酮類物質還影響著植物其他次生代謝途徑[18]。

通過轉錄組測序，我們得到了大量基因序列，從中篩選得到了一個CHS的編碼序列。本實驗中PaCHS1序列是采用同源克隆方法首次從苦蘵中克隆到CHS的編碼基因，并對其進行了初步的生物信息學分析。PaCHS1與其他物種的CHS有較高的同源度。同時，其他生物信息學分析還表明，PaCHS1蛋白沒有跨膜結構，不含有信號肽，是非分泌蛋白。而亞細胞定位預測將蛋白定位于細胞膜和細胞質中，符合其為代謝酶的特征，滿足CHS蛋白發揮催化作用的要求[4]。由此可見，所克隆的PaCHS1為查爾酮合成酶編碼基因CHS的同源基因，這為更加全面地研究苦蘵次生代謝的調控機制以及黃酮合成與激素之間的相互聯系提供了參考。

取苦蘵不同部位的組織器官進行PaCHS1的表達分析實驗，為進一步研究PaCHS1的作用方式具有一定的參考價值。定量PCR的實驗結果表明，PaCHS1基因在苦蘵各個組織中均有表達，這說明黃酮類物質廣泛存在于苦蘵體內。有研究表明，不同成熟期金櫻子果黃酮類物質的含量和種類有著很大的差別[19]。此外，桃果實成熟過程中類黃酮類物質的積累也存在顯著的變化[20]。我們的結果表明，PaCHS1的表達量在不同組織器官中的高低不同，存在明顯的組織特異性。尤其在果實中，PaCHS1含量顯著高于其他組織。這暗示了黃酮類物質的積累，可能與苦蘵果實成熟密切相關。苦蘵果實積累了大量次生代謝活性物質，研究果實發育成熟相關P450基因，為我們揭示苦蘵活性物質的生物合成提供了基礎[21-22]。

大量研究表明，外源植物激素對植物次生代謝過程中的主要代謝物積累有著動態的影響。諸如，赤霉素、細胞分裂素、茉莉酸等植物激素，都能改變藥用植物有效次生代謝物的含量和分布[23-24]。在本實驗中，我們選取了其中常見的植物激素，如生長素、細胞分裂素、水楊酸、赤霉素、乙烯、油菜素內酯和茉莉酸等，比較了PaCHS1在多種激素處理下的表達變化。在藥用植物中，茉莉酸甲酯是一種重要的次生代謝調控分子，外源施加茉莉酸甲酯可以明顯的提高包括黃酮類物質在內的多種次生代謝物的積累[25-26]。我們發現，PaCHS1基因在茉莉酸的處理下，表達水平上升超過5倍。這說明，茉莉酸參與了PaCHS1控制的苦蘵黃酮合成途徑的調控。

目前對苦蘵次生代謝功能基因鑒定和克隆尚未見諸報道，但其他高等植物的次生代謝調控關鍵基因的研究已經為苦蘵基因的克隆和代謝途徑解析奠定了一定的基礎。對苦蘵PaCHS1的克隆和表達譜的研究，可為研究苦蘵以黃酮類物質為代表的次生代謝途徑打下基礎，同時結合分子育種，為苦蘵活性物質的生產做出理論和實踐的指導。

參考文獻：

[1] HANASAKI Y, OGAWA S, FUKUI S.The correlation between active oxygens scavenging and antioxidative effects of flavonoids[J]. Free Radical Biology & Medicine,1994, 16(6):845-850.

[2] 諸姮, 胡宏友, 盧昌義, 等.植物體內的黃酮類化合物代謝及其調控研究進展[J]. 廈門大學學報(自然版), 2007, 46(增刊1):136-143.

[3] 沈忠偉, 許昱, 夏犇, 等.植物類黃酮次生代謝生物合成相關轉錄因子及其在基因工程中的應用[J]. 分子植物育種, 2008, 6(3):542-548.

[4] MARTIN C R. Structure, function, and regulation of the chalcone synthase[J]. International Review of Cytology-a Survey of Cell Biology, 1993, 147:233-284.

[5] JEZ J M, FERRER J L, BOWMAN M E, et al. Structure and mechanism of chalcone synthase-like polyketide synthases[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2001, 27(6):393-398.

[6] AUSTIN M B, NOEL J P. The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases[J]. Natural Product Reports, 2003, 20(1):79-110.

[7] SCHR?DER J. A family of plant-specific polyketide synthases: facts and predictions[J]. Trends in Plant Science, 1997, 2(10):373-378.

[8] 包穎, 郭昌鋒, 陳少華, 等. 植物查爾酮合成酶超基因家族的分子進化[J]. 植物學報,2015, 50(1):55-71.

[9] SCHR?DER J. The family of chalcone synthase-related proteins: Functional diversity and evolution[J]. Recent Advances in Phytochemistry,2000, 34:55-89.

[10] 中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志 第67卷第1冊茄科[M]. 北京：科學出版社，1990.

[11] 楊燕軍, 陳梅果, 胡玲, 等.苦蘵的化學成分研究[J]. 中國藥學雜志,2013, 48(20):1715-1718.

[12] ISMAIL N, ALAM M. A novel cytotoxic flavonoid glycoside fromPhysalisangulata[J]. Fitoterapia,2001, 72(6):676-679.

[13] AUGUSTINE A A, UFUOMA O. Flavonoids from the leaves ofPhysalisangulataLinn[J]. Planta Medica,2013,79:PJ5.

[14] 牛天敏, 馬會勤, 陳尚武.大豆查爾酮合成酶(CHS)基因的克隆、表達及其在雪蓮提取液中的代謝產物分析[J]. 中國生物工程雜志,2007, 27(2):58-63.

[15] 陳喆, 朱凡凡, 馬忠俊, 等.苦蘵內酯P在制備抗腫瘤藥物中的應用: CN201410209628.2 [P]. 2014-08-06.

[16] ZHU F, DAI C, FU Y, et al. Physalin A exerts anti-tumor activity in non-small cell lung cancer cell lines by suppressing JAK/STAT3 signaling[J]. Oncotarget, 2016, 7(8):9462-9476.

[17] 方春生, 楊燕軍. 酸漿苦素B的體外抗腫瘤活性研究[J]. 廣州中醫藥大學學報, 2015(4):652-655.

[18] 王軍妮, 黃艷紅, 牟志美, 等. 植物次生代謝物黃酮類化合物的研究進展[J]. 蠶業科學, 2007, 33(3):499-505.

[19] 嚴振宇. 不同成熟期金櫻子果黃酮類物質的含量與類別分析[D]. 衡陽：南華大學，2014.

[20] 周君, 陳宗玲, 張瓊, 等. 套袋對桃果實成熟過程中酚酸類和類黃酮類物質積累的影響[J]. 園藝學報，2009, 36(12):1717-1724.

[21] 張輝.毛酸漿宿萼的化學成分研究[D]. 蘇州：蘇州大學，2010.

[22] 張初航. 錦燈籠的活性成分及質量評價研究[D]. 沈陽：沈陽藥科大學，2009.

[23] 符小發. 外源植物激素對葡萄果實發育過程中主要次生代謝產物積累動態的影響[D]. 石河子：石河子大學，2010.

[24] 田嬌, 劉園, 房敏峰.外源茉莉酸類激素對藥用植物次生代謝的影響研究[J]. 天然產物研究與開發，2015, 27(1):185-190.

[25] 楊英, 鄭輝, 李赟, 等.茉莉酸甲酯與二氫茉莉酮酸甲酯對懸浮培養的甘草細胞生長和黃酮積累的影響[J]. 植物生理學報，2008, 44(5):903-906.

[26] 劉雅靜, 邢菊展, 張宇婷, 等.茉莉酸甲酯,蔗糖和氮源對蒙古黃芪愈傷組織生長和黃酮含量的影響[J]. 內蒙古大學學報(自然版)， 2012, 43(1):65-70.