光能變價離子鈦對煙草青枯雷爾氏菌和野火病菌的抑制作用

余佳敏，劉 穎，肖建華，肖 勇，江 鴻，余祥文*

(1.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610041； 2.西南大學植物保護學院，天然產物農藥研究室，重慶 400715；3.湖北中煙工業有限責任公司，湖北 武漢 430040)

煙草青枯病和野火病是煙草生長過程中重要的細菌性病害。其中，青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，以下簡稱青枯菌)引起的一種土傳病害，煙株根、莖、葉均可受害，在我國南方煙區，尤其在廣東、福建、湖南、四川和貴州發病嚴重[1]，帶來巨大經濟損失。而煙草野火病則由煙草假單胞桿菌屬，丁香假單胞煙草致病變種(Pseudomonassyringaepv.tabaci)引起，主要為害煙草葉部，在云南、貴州、四川等省份發生較為普遍[2]。目前對這2種病害的防治仍以化學防治為主，但化學防治導致農藥殘留、土壤生態環境的破壞等問題越來越突出。因此，探索開發抑制青枯病菌和野火病菌的高效、低毒新藥劑具有十分重要的意義。

近年來，鈦(Ti)在農作物上的研究越來越廣泛，煙草上也做了大量研究。刑小軍等[3-5]曾報道鈦對烤煙和白肋煙煙株長勢和煙葉品質方面有顯著作用；焦湞等[6]曾報道低劑量鈦離子注入煙草種子可以引起種子發芽率及葉片含鉀量提高；張永輝等[7]曾報道鈦土肥對烤煙早花有一定的抑制作用。除了在生長發育、產值產量等方面對作物存在影響外，在病害防治方面鈦也能起到一定作用。有研究指出，鈦對黃瓜霜霉病、白粉病、番茄和玫瑰的細菌性葉斑病的發生有一定的抑制作用[8-10]，對黃瓜細菌性角斑菌、茄假單孢菌、水稻白葉枯菌、婁徹氏霉菌、植物冠癭瘤致病菌根癌農桿菌等有一定的抑菌效果[11-12]。此外，Goswani等[13]的研究也表明，鈦對稻米象有一定的防效。但目前其在煙草病蟲害防治方面仍沒有相關研究報道。

此外，據報道，與Ti相關的TiO2及光能變價離子鈦(TIVL)對多種細菌有良好的殺菌效果[12,14]。基于此，本實驗選擇TIVL作為處理藥劑，以煙草青枯菌和野火病菌作為研究對象，探究鈦離子對煙草青枯菌以及野火病菌的抑制作用，為進一步研究離子鈦抑制青枯菌和野火病的作用機理奠定基礎，同時也為應用離子鈦防治煙草青枯病和野火病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

光能變價離子鈦(TIVL)，簡稱離子鈦，由鈦谷(天津)科技有限公司惠贈，未添加其他金屬元素，鈦離子母液濃度為4 mg·mL-1。

1.1.2 供試菌種

青枯菌菌株，由西南大學植物保護學院天然產物農藥研究室提供，分離自煙草青枯病病株。

野火病菌菌株，由西南大學植物保護學院天然產物農藥研究室提供，分離自煙草野火病病株。

1.2 處理設計

1.2.1 供試培養基的準備

NA培養基：葡萄糖10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏1.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水 1 000 mL，調節pH值6.8～7.0，121 ℃滅菌20 min。

B培養基：胰蛋白胨10.0 g，酪朊水解物1.0 g，酵母提取物1.0 g，蒸餾水1 000 mL，在121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 供試菌劑的準備

取保存的青枯菌和野火病菌菌株于NA平板上劃線，并置于(30±2)℃培養箱中培養48 h，待長出單菌落后，挑取單菌落于液體B培養基中培養12～16 h，至D600為1.0(≈109mL-1)，離心收集菌體重懸于無菌水中，再以無菌水進行10倍梯度稀釋至約103mL-1備用。

1.2.3 平板抑菌試驗

用150 mL三角瓶，配制固體NA培養基60 mL·瓶-1。高壓滅菌后，冷卻至約45 ℃左右，分別添加母液濃度為4 mg·mL-1的離子鈦0、120、240、360、480、540 μL，使其終濃度分別為0、8、16、24、32、36 mg·mL-1，未加離子鈦(0 mg·mL-1)的培養基為對照。搖勻后倒平板，每60 mL培養基倒3個平板，為3個重復。凝固后，吹干冷凝水，分別添加已備好的103mL-1青枯菌或野火病菌菌株，放入10～20顆滅菌玻璃珠進行涂布。

將各處理放入(30±2)℃培養箱中倒置培養，分別于24、36、48、72和96 h拍照記錄實驗結果。

1.2.4 MIC和MBC測定

離子鈦對青枯菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測定是通過在固體培養基上菌株的存活力決定[15]。已熔化的NA培養基冷卻至45 ℃左右加入離子鈦母液配置成終濃度為0、8、16、24、32、36 mg·L-1的帶藥培養基，充分混勻后，每皿20 mL，倒入培養皿中制成帶藥平板。在帶藥平板上均勻涂布100 μL菌懸液(約105mL-1)，隨后放入(30±2)℃培養箱中倒置培養，培養48和96 h后拍照記錄實驗結果。

1.2.5 生長曲線

在50 mL的無菌的三角瓶中配制0(為空白對照)、16、24、32、36 mg·L-1的帶藥B培養基，然后在超凈工作臺中分別于每瓶中加入D600=1.0的菌懸液，混合均勻后最終形成最終菌含量約5×106mL-1的樣品，置于(30±2)℃、180 r·min-1的搖床中培養，每隔2 h在無菌條件下取樣3 mL，利用紫外分光光度計600 nm檢測吸光值，各濃度重復3次。以取樣時間為橫坐標，總長為24 h，各濃度下菌懸液的光密度值為縱坐標，分別繪制不同濃度離子鈦影響下青枯病菌和野火病菌的生長曲線圖。

1.2.6 數據分析

在Excel 2010中對數據進行初步整理，用Sigmaplot對數據進行作圖。

2 結果與分析

2.1 平板抑菌

利用平板帶藥法測定不同濃度光能變價離子鈦對煙草青枯菌和野火病菌菌落生長的抑制情況。從圖1和圖2可以看出，離子鈦對青枯菌和野火病菌菌落生長的抑制作用具有顯著的濃度效應，即隨著瓊脂平板中添加藥劑濃度的升高，對菌落生長的抑制作用也隨之增強。隨著離子鈦濃度增加，菌落生長所需時間越長，菌落個數稍有減少，但是差異不顯著。當離子鈦濃度為32 mg·L-1時，野火病菌在48 h時即生長出菌落，而青枯菌則培養至96 h才出現菌落；當離子鈦濃度為36 mg·L-1時，培養96 h后2種細菌均未長成菌落。說明離子鈦對煙草青枯菌和野火病菌均有較好抑制作用。

2.2 MIC和MAC

記錄培養48和96 h后病菌在含不同濃度離子鈦的培養基中的生長情況，培養48 h后平板上無菌落生長的處理濃度為MIC，96 h后無菌落生長的處理濃度為MBC。從圖3和圖4可以看出，離子鈦對青枯菌的MIC和MBC分別為32 mg·L-1和36 mg·L-1，而對煙草野火病菌的MIC和MBC均為36 mg·L-1。

圖1 在含不同濃度光能變價離子鈦的培養基中青枯菌的生長狀況

圖2 在含不同濃度光能變價離子鈦的培養基中野火病菌的生長狀況

2.3 生長曲線

根據最小抑菌濃度(MIC)設置4個濃度進一步探索光能變價離子鈦在不同濃度下對煙草青枯病菌和野火病菌生長的影響，由于野火病菌在32和36 mg·L-1時完全抑制病菌生長，故本文只選擇32 mg·L-1及以下的濃度。結果(圖5)表明，在24 mg·L-1濃度下，煙草青枯菌和野火病菌生長對數期均被延后，最終生長濃度也低于對照處理；而32 mg·L-1濃度時則完全抑制青枯病菌和野火病菌生長。由此可見，光能變價離子鈦隨著濃度升高，對煙草青枯病菌和野火病菌的抑制作用增強。

圖3 不同濃度光能變價離子鈦培養48 h和96 h后對青枯菌菌落的生長影響

圖4 不同濃度光能變價離子鈦培養48 h和96 h后對野火菌菌落的生長影響

圖5 不同濃度光能變價離子鈦對青枯病菌(A)和野火病菌(B)生長的影響

3 討論

煙草是吸食葉片的特殊作物，對農殘要求甚高，高毒低效、安全無污染的農藥是當前綠色防控的必然趨勢。鈦對煙草有增產提質作用[3-5]，對多種病菌有抑制作用[8-12,14]，且對環境和生物無害[16]，有望成為替代其他化學產品的新型農藥。

本研究開展了煙草青枯菌和野火病菌在不同濃度TIVL中的平板抑菌試驗、MIC和MBC測定以及生長曲線試驗。結果表明，TIVL對煙草青枯菌和野火病菌均有較好抑制作用，對煙草青枯菌的MIC和MBC為32 mg·L-1和36 mg·L-1，對煙草野火病菌MIC和MBC均為36 mg·L-1，且2種病菌在含有32 mg·L-1TIVL的培養液中均不能生長。本實驗初步表明，高濃度TIVL對煙草青枯病和野火病菌有抑制作用，其抑菌濃度分別為32和36 mg·L-1。此結果與范延芬等[12]對青枯病菌雷爾氏菌的研究結果大致一致，但是抑菌濃度稍有差異，可能與青枯病菌原液濃度和培養基不同有關系。雖然沒有相關研究開展離子鈦與野火病菌的關系，但范延芬等[12]的實驗中推測出TIVL具有廣譜抑菌效果。Vatansever等[14]開展的研究表明，TiO2對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌及單細胞藻類均有良好的殺滅效果，與本實驗中高濃度的TIVL能抑制野火病菌生長相對應。

雖然高濃度TIVL對煙草青枯病菌和野火病菌有抑制作用，但是其作用機理尚未明確，還需進一步試驗探索驗證。但TIVL是廣譜性抑菌劑，在多種作物上均有較好效果，應用前景良好，人們對用該物質防治病蟲害的研究將會日趨完善，這將為TIVL防治病蟲害，解決農藥污染，提高農產品安全提供新思路。

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