棘胸蛙虹彩病毒疫苗制備及免疫技術

胡靄臻，鄭善堅*，林威丞，金米雪，謝夢佳，包伊鵬，李 柯

(浙江師范大學 a生化學院，b野生動物生物技術與保護利用浙江省重點實驗室，浙江 金華 321004)

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，又名石蛙，是我國棘蛙屬中分布最廣的物種之一。棘胸蛙主要分布于云南、貴州、安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、福建、廣東、廣西和香港等地[1]。20世紀80年代以后，我國棘胸蛙產業已初具規模，并且呈現快速發展的趨勢[2]。

蛙病毒屬病毒宿主廣泛，可以感染爬行類、魚類和兩棲類，大部分病毒對宿主都有較強的致病性和致死性[3-4]。2016年本實驗室從浙江麗水某養殖場的棘胸蛙上分離到虹彩病毒科、蛙病毒屬病毒，暫命名為棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)。感染該病毒的蛙腹部發紅，頭部、四肢皮膚潰爛，死亡率高達90%以上。免疫防治被認為是目前防治蛙等水生動物病毒性疾病的最有效、最安全和最有潛力的方法之一[5]，本文就棘胸蛙虹彩病毒的疫苗制備及免疫方法進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)為本實驗室提供；實驗用棘胸蛙來自綠谷清泉石蛙養殖合作社，平均規格(52±3.5)g；病毒DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；EPC細胞由浙江省淡水水產研究所惠贈；ELISA試劑盒、M119培養基(Gbico，11150059)、胎牛血清(BI，0010316)、β-丙內酯(索萊寶公司，20170711)、二乙烯亞胺(Sigma，8044)購自江蘇凱基生物公司。

1.2 病毒培養

選擇生長良好的EPC細胞接種棘胸蛙虹彩病毒，23 ℃培養箱中培養，待細胞脫落75%以上時收集病毒，-20 ℃中保存[6]。將所有制得的病毒液混合，按Reed-Muench法計算病毒滴度[7]。將病毒液稀釋至1×108TCID50·mL-1，作為制備疫苗的原材料。

1.3 疫苗滅活條件的篩選

1.3.1 疫苗的制備

根據文獻[8]，將收集的病毒稀釋液分別用終濃度為0.025%、0.050%、0.100%、0.200%的β-丙內酯(BPL)、福爾馬林，終濃度為0.5%、1.0%、2.0%和3.0%二乙烯亞胺(BEI)滅活劑滅活。BPL滅活溫度為4 ℃，福爾馬林、BEI滅活溫度為37 ℃；滅活時間分別為24、48、72、96 h。將制得疫苗暫存在4 ℃冰箱中。

1.3.2 疫苗的安全性檢驗

將所制得的疫苗分別接種于EPC細胞，設置2個重復；同時，設置接種棘胸蛙虹彩病毒的陽性對照組和滅菌純水的空白對照組。將未出現細胞病變效應的細胞凍融3次后，在EPC細胞上盲傳3代，每代培養7 d，逐日觀察細胞病變情況[9]。

1.3.3 疫苗的無菌檢驗

將所制得的疫苗分別接種于LB固體培養基，37 ℃培養3 d，觀察培養基中有無細菌生長。

1.3.4 疫苗的PCR檢測

根據病毒DNA提取試劑盒提取疫苗和病毒核酸，以蒸餾水為空白對照進行PCR擴增。PCR條件為預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 40 s；退火52 ℃ 40 s、延伸72 ℃ 40 s，30個循環；再延伸72 ℃ 10 min。反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果[10-11]。

1.4 免疫途徑

將棘胸蛙隨機均分為6組，每組20只。3組為注射組，A、B組分別肌肉注射0.2 mL 1×107TCID50·mL-1、1×108TCID50·mL-1的疫苗，C組注射等劑量的PBS。3組為噴霧組，D、E組分別用噴壺將0.2 mL 1×107TCID50·mL-1疫苗噴至霧蛙皮膚，D組噴霧1次，E組每隔10 min噴霧1次，共噴霧5次，F組噴純水；噴霧結束10 min后放回養殖池。免疫后每隔7 d心臟采血1次，至第28 d共采血4次。將血樣室溫靜置1 h，4 ℃冰箱靜置24 h，3 000 r·min-1離心10 min，取上清備用。

1.5 免疫效果評價

1.5.1 血清抗體效價檢測

將疫苗12 000 r·min-1離心15 min，取上清，用包被液稀釋，在96孔酶標板各孔中加入稀釋的抗原100 μL，37 ℃溫箱孵育，2 h后取出甩干各孔包被液，每孔加入封閉液100 μL，37 ℃孵育1 h后甩干封閉液，用洗滌液洗板2次。將待測血清用洗滌液從1∶5倍比稀釋至1∶1 280，每個稀釋度8個重復，每孔加入100 μL不同稀釋度的血清，并設置洗滌液為空白對照。37 ℃培養箱溫浴1 h，洗板4次；在酶標板各孔加入1∶5 000稀釋的HRP標記羊抗兔IgG 100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板5次；

各孔加入TMB顯色液100 μL，室溫避光靜置10 min后加入終止劑終止反應。在405 nm波長下，測定光密度值。陽性判斷標準：檢測孔D值/陰性孔D值，>2.1為陽性，<1.5為陰性，1.5～2.1為可疑。以出現陽性孔的最高稀釋度作為待檢血清效價[12-13]。

1.5.2 相對免疫保護率檢測

免疫后35 d，選擇抗體效價較高表噴霧免疫組和注射免疫組進行攻毒試驗，同時設1組未經免疫的空白對照組。每組6只棘胸蛙，分別肌肉注射0.2 mL的1×107TCID50·mL-1病毒液。攻毒后每天觀察并記錄感染發病與死亡情況，連續觀察21 d，計算相對免疫保護率[14]。

2 結果與分析

2.1 病毒培養情況

不同稀釋度的病毒液接種后4 d，出現明顯的細胞病變現象，單層細胞呈破網狀(圖1)。共制得300 mL病毒液，混合后，采用Reed-Muench法計算病毒滴度，結果為108.125 TCID50·mL-1。

圖1 病毒培養

2.2 疫苗滅活條件

2.2.1 滅活劑滅活濃度和時間

將不同滅活劑、滅活條件制備的疫苗接種于96孔板中的EPC細胞，將未出現病變的細胞盲傳3代。根據細胞的病變情況，在每組滅活劑中篩選出最適宜濃度和時間的疫苗，得出使用0.1% β-丙內酯4 ℃滅活72 h、0.2%福爾馬林37 ℃滅活72 h、1%二乙烯亞胺37 ℃滅活48 h的疫苗符合上述滅活要求(表1)。

表1 疫苗制備條件篩選

注：+++表示未傳代即檢測到病毒，++為第1次盲傳后檢測到病毒，+為第2次盲傳后檢測到病毒，-為3次盲傳均未檢測出病毒。

2.2.2 疫苗安全性

將疫苗接種于普通營養瓊脂培養3 d后，觀察到培養基上無細菌生長，表明疫苗沒有細菌污染。將3組最適滅活條件下制備的疫苗，PCR擴增后未檢測出虹彩病毒核酸靶基因(圖2)，說明0.1% β-丙內酯4 ℃滅活72 h、0.2%福爾馬林37 ℃滅活72 h、1%二乙烯亞胺37 ℃滅活48 h能夠徹底滅活病毒，且安全性較好。考慮4 ℃條件下滅活對抗原破壞性小，確定以0.1%丙內酯4 ℃滅活72 h制備的疫苗進行免疫。

M為DNA marker；1為病毒對照；2為陰性對照(水)；3為β-丙內酯滅活組；4為福爾馬林滅活組；5為二乙烯亞胺滅活組圖2 蛙虹彩病毒滅活處理后的PCR鑒定結果

2.3 免疫途徑

2.3.1 血清中和抗體效價

用不同方法對棘胸蛙接種疫苗后，其血清中和抗體效價相比對照組有顯著升高(表2)。注射免疫組在21 d時達到最高的抗體效價，其中注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗組血清中和抗體效價達到最高的380.2。噴霧免疫組出現最高抗體效價時間晚于注射免疫組，其中噴霧1次0.2 mL 1×107TCID50·mL-1組棘胸蛙血清中抗體效價在28 d時最高，為160。結果表明，注射免疫和噴霧免疫都能在一定時間內產生較高的抗體效價，噴霧免疫需要更長的時間才能發揮較好的免疫作用。

表2 注射免疫組血清抗體效價

2.3.2 相對免疫保護力

對照組在病毒攻毒感染后的第8 d出現發病癥狀，第11 d開始死亡，21 d時共死亡5只，死亡率為83.3%。注射免疫和噴霧免疫組在攻毒后第13 d有死亡，第14 d以后皆無發病死亡情況(表3)。根據公式計算，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗組的相對免疫保護率為80%，噴霧5次組的相對免疫保護率為60%。

表3 不同免疫組棘胸蛙死亡情況 只

3 小結和討論

病毒滅活是制備疫苗的關鍵步驟之一。福爾馬林是一種最常用的滅活劑，主要使病毒核酸變性而達到滅活病毒的效果。但是福爾馬林對病毒的衣殼蛋白存在破壞作用，易使病原體蛋白的抗原性降低[15]。β-丙內酯、二乙烯亞胺對病毒具有很強的滅活作用，能作用于病原體DNA，改變其結構從而達到滅活目的；其不直接作用于蛋白，不破壞病毒的免疫原性，在維持病毒免疫原性方面優于福爾馬林[15-20]。考慮滅活溫度對抗原的結構會造成破壞，而4 ℃條件對病毒的抗原影響最小，因此確定0.1% β-丙內酯4 ℃滅活72 h是棘胸蛙虹彩病毒疫苗制備的最適條件。

血清抗體水平的高低與動物機體的免疫保護效果有著密切的關系[21]。采用注射和噴霧的免疫方法對棘胸蛙進行免疫都產生較好的免疫效果。注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗免疫組在21 d時達到最高的血清中和抗體效價380.2，噴霧1×107TCID50·mL-1疫苗5次免疫組在28 d時出現較高的血清中和抗體效價360，噴霧免疫相比注射免疫發揮免疫保護作用相對滯后。相對免疫保護力檢測表明，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1疫苗免疫組的相對免疫保護率達到80%，間隔10 min噴霧5次1×107TCID50·mL-1疫苗免疫組的相對免疫保護力為60%。因此，注射0.2 mL 1×108TCID50·mL-1棘胸蛙虹彩病毒疫苗后，免疫保護效果最佳。噴霧疫苗時，隨著噴霧次數增加，免疫效果進一步增強，雖然效果上仍不如注射免疫，但是其操作簡便、快速、無損傷，可作為大規模棘胸蛙虹彩病毒疫苗免疫的有效途徑。

魚類的注射免疫和浸泡免疫已有較多應用[22]。棘胸蛙屬于兩棲動物，在免疫系統的發育上要比魚類高等。兩棲類動物的蛙類可以離開水體進行長時間的陸地上生活，其體表皮膚還富含粘液腺和淋巴間隙，兼有皮膚輔助呼吸功能。因此，對蛙類采取體表噴霧免疫，可以通過皮膚進行疫苗吸收，刺激機體產生相應免疫作用。研究結果表明，采用注射免疫或噴霧免疫都能對棘胸蛙虹彩病毒產生較好的免疫保護效果，為今后蛙病疫苗的開發研究與應用提供良好前景。

參考文獻：

[1] 于曉云. 棘胸蛙MHCⅡB基因的克隆、多態性及其與嗜水氣單胞菌感染的抗病相關性研究[D]. 金華：浙江師范大學, 2012.

[2] 梅祎蕓, 葉容暉, 宋婷婷,等. 浙江省棘胸蛙養殖現狀及發展對策[J]. 浙江農業科學, 2015, 56(7):1122-1125.

[3] 鄧敏, 龍綮新. 鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)PCR檢測方法的建立及虹彩病毒新證據[J]. 病毒學報, 2000, 16(4):365-369.

[4] GIBSON-KUEH S, NETTO P, NGOH-LIM G H, et al. The pathology of systemic iridoviral disease in fish[J]. Journal of Comparative Pathology, 2003, 129(2/3):111-119.

[5] 盛慧英, 吳小平, 張奇亞. 單克隆抗體技術在水生動物病毒研究中的應用[J]. 中國病毒學, 2003, 18(2):187-190.

[6] 李有文, 魏風, 郭志儒,等. 山羊痘病毒培養及其細胞病變觀察研究[J]. 安徽農業科學, 2009, 37(3):1102-1104.

[7] REED J L. A simple method for estimating fifty percent end points[J]. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1938, 27(3): 493-497.

[8] 孫建濱, 曾令兵, 張輝,等. 大鯢虹彩病毒β-丙內酯滅活方法的研究[J]. 淡水漁業, 2013, 43(3):66-71.

[9] 逯忠新, 趙萍, 邵英德,等. 豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗的研究——菌種選擇、疫苗制備及安全性試驗[J]. 中國獸醫科學, 2002, 32(3):7-9.

[10] 張旻, 林祥梅, 江育林. 蛙虹彩病毒巢式PCR檢測方法的建立[J]. 中國水產科學, 2011, 18(3):661-666.

[11] 王芳, 康超, 李永霞,等. 大鯢虹彩病毒套式PCR診斷方法的建立及應用[J]. 江蘇農業科學, 2016, 44(8):291-293.

[12] 王琳琳, 楊娜, 袁悅,等. 人葉酸受體自身抗體IgG酶聯免疫吸附試驗檢測方法的建立及評價[J]. 北京大學學報醫學版, 2014, 46(3):483-487.

[13] 黃立平, 劉長明, 危艷武,等. 豬圓環病毒2型血清中和抗體阻斷ELISA檢測方法的建立及應用[J]. 中國獸醫科學, 2009, 39(9):779-785.

[14] 奕志娟. 草魚出血病細胞滅活疫苗的免疫效果評價[D]. 溫州：溫州醫科大學, 2015.

[15] 徐守振, 王新, 尹燕博. 四種不同滅活劑對新城疫病毒的滅活效果研究[J]. 中國家禽, 2011, 33(14):15-19.

[16] 傅元華, 劉俊斌, 錢鐘,等. 二乙烯亞胺對豬細小病毒的滅活作用[J]. 中國動物傳染病學報, 2012, 20(1):73-76.

[17] 張智明, 王全杰, 竇海艷,等. 二乙烯亞胺對豬偽狂犬病病毒滅活效果研究[J]. 中國獸藥雜志, 2015, 49(6):9-12.

[18] 衛龍興, 王福泉. 動物疫苗中滅活劑與佐劑的種類及其作用[J]. 現代農業科技, 2009(19):321-321.

[19] HABIB M, HUSSAIN I, FANG W H, et al. Inactivation of infectious bursal disease virus by binary ethylenimine and formalin[J]. Journal of Zhejiang University Science B, 2006, 7(4):320-323.

[20] JAGT H J M, BEKKERS M L E, BOMMEL S A J T V, et al. The influence of the inactivating agent on the antigen content of inactivated Newcastle disease vaccines assessed by the in vitro, potency test[J]. Biologicals, 2010, 38(1):128-134.

[21] TORT L B J, BALASCH J C, MACKENZIE S. Fish Immune System. A crossroads between innate and adaptive responses[J]. Inmunología, 2003, 22(3):277-286.

[22] 周偉東, 周勇, 劉奕,等. DNA疫苗浸泡免疫預防鱖魚傳染性脾腎壞死病毒[J]. 湖北農業科學, 2017, 56(14):2731-2735.