嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響因素

馮 富，曲業鵬，馬有智

(浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310058)

生物被膜是一種附著于生物或非生物表面，包裹著由其自身產生的細胞外多聚基質、具有三維結構的細胞群體[1]，是細菌生長過程中為適應生存環境而在固體表面上生長的一種與游離菌相對應的存在形式[2]。據報道，細菌形成生物被膜存在免受外界傷害、營養條件豐富、細菌與細菌間形成共同體以及細菌自我編碼的生存方式等多種誘因[3]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila，AH)在自然界中廣泛分布，對水產動物、畜禽和人類均有致病性，可引起多種水產動物的敗血癥和人類腹瀉，往往給淡水養殖業造成慘重的經濟損失。近年來嗜水氣單胞菌生物被膜引起了國內外學者的關注，已有研究將嗜水氣單胞菌生物被膜作為口服疫苗[4]，而生物被膜形成影響因素方面鮮有報道。本研究采用生物被膜體外定量檢測方法，探討了時間、溫度、Ca2+、Mg2+、葡萄糖以及人纖維蛋白原對嗜水氣單胞菌生物被膜形成的影響，為制備生物被膜條件優化提供了數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料

嗜水氣單胞菌AH-X由浙江大學水產動物健康養殖實驗室提供；TSA培養基、BHI培養基購自北京陸橋技術股份有限公司；LB培養基按常規使用方法配制；人纖維蛋白原購自上海生工生物技術有限公司。

1.2 生物被膜的形成與測定

生物被膜制備與定量檢測參考Stepanovic等[4-5]的96孔板法并加以改進，具體步驟如下：菌懸液與培養基按1∶100體積混合均勻后取200 μL加入到96孔細胞培養板小孔中，25 ℃(或37 ℃)靜置培養后棄去培養液，用生理鹽水250 μL清洗3次以去除游離菌，55 ℃烘箱干燥后往各孔加入200 μL甲醇，固定15 min，室溫干燥；往各孔加入200 μL 0.1%結晶紫溶液，室溫染色30 min后棄去染色液，0.85%生理鹽水250 μL清洗3～5次；55 ℃干燥后各孔加入33%乙酸200 μL，待完全溶解后用酶標儀測定D570值。

1.3 培養時間對生物被膜形成的影響

將培養時間設置為2、8、12、20、24、36、48 h，按1.2方法測定不同培養時間生物被膜的D570值。

1.4 培養溫度對生物被膜形成的影響

將培養溫度設置為25、37 ℃，按1.2節方法測定各培養溫度所形成的生物被膜的D570值。

1.5 葡萄糖對生物被膜形成的影響

添加2%、3%、4%、5%、6%、8%、10%和20%不同濃度梯度的葡萄糖于LB培養基中作為能量來源，用優化后的最佳條件25 ℃培養AH-X，按1.2節方法測定各培養溫度所形成的生物被膜的D570值。

1.6 Ca2+、Mg2+對生物被膜形成的影響

分別向LB培養基中添加CaC12、MgC12至終濃度為0.1、1.0和10.0 mmoL·L-1，按1.2節方法測定添加CaC12和MgC12所形成的生物被膜的D570值。以不添加CaC12、MgC12的LB培養基為陰性對照。

1.7 人纖維蛋白原對生物被膜形成的影響

分別向LB培養基中添加人纖維蛋白原至終濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·mL-1，按1.2節方法測定各濃度的生物被膜形成量。

1.8 數據處理

實驗結果以平均數±標準偏差表示，采用Excel、Graphpad prism 5軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 培養時間對生物被膜形成的影響

采用LB培養基，在不同的培養時間對生物被膜進行測定。如圖1所示，培養2 h后生物被膜已經開始形成，在12 h時生物被膜D570達到峰值。

圖1 培養時間對生物被膜形成量的影響

2.2 培養溫度對生物被膜形成的影響

如圖2所示，將嗜水氣單胞菌分別置于25 ℃與37 ℃培養，分別取3個時間點16、24和48 h進行測定，25 ℃條件培養下形成生物被膜的D570值均高于37 ℃，經統計分析均為差異極顯著。

圖2 培養溫度對生物被膜形成量的影響

2.3 葡萄糖對生物被膜形成的影響

如圖3所示，在葡萄糖濃度從0到2%時嗜水氣單胞菌生物被膜形成的D570值極顯著增加，當濃度大于3%時，AH生物被膜的D570值隨葡萄糖濃度增加而下降，大于6%后趨于平穩。

圖3 葡萄糖對生物被膜形成量的影響

2.4 Ca2+、Mg2+ 對生物被膜形成的影響

如圖4所示，隨著Ca2+濃度的增加，生物被膜形成量呈現上升趨勢。當氯化鈣濃度到達10.0 mmoL·L-1時，嗜水氣單胞菌生物被膜形成量顯著高于對照組和0.1、1.0 mmoL·L-1添加組。如圖5所示，添加氯化鎂各組之間形成生物被膜量沒有顯著差異。

圖4 Ca2+對生物被膜形成量的影響

圖5 Mg2+ 對生物被膜形成量的影響

2.5 人纖維蛋白原對生物被膜形成的影響

如圖6所示，添加不同濃度纖維蛋白原各組生物被膜形成的D570與不添加纖維蛋白原的組差異極顯著，添加不同濃度纖維蛋白原的各組間無顯著差異。

圖6 人纖維蛋白原對生物被膜形成量的影響

3 討論

Abdallah等[6]研究發現溫度對生物被膜的形成影響極顯著，Fuchs等[7]發現溫度同時影響生物被膜形成量和結構。本研究結果顯示25 ℃條件下生物被膜的形成量顯著高于37 ℃，與其結果一致，由此推測嗜水氣單胞菌生物被膜形成的最適溫度可能在25～30 ℃。

一定濃度葡萄糖有利于嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，生物被膜形成量顯著上升，其原因可能是一定濃度葡萄糖可以促進嗜水氣單胞菌的生長，并且可以增加細菌間的黏合度，更利于形成生物被膜或已形成的生物被膜不易被分解[8-9]。當葡萄糖濃度大于3%時反而對生物被膜的形成有抑制作用，其可能原因是葡萄糖濃度過高，造成滲透壓過高，對細菌的增殖有抑制作用，因此生物被膜的形成量會在一定程度上減少。據文獻報道，在低營養的M63培養基中添加葡萄糖以后有利于生物被膜的形成[10]，與以上研究結果一致。

Kannan等[11]研究結果顯示鈣離子促進胞外多糖形成以及提高黏附力的作用遠遠大于鎂離子，從而更有利于生物被膜的形成與穩固。殷文政等[12]研究了4種金屬陽離子(Mg2+、Ba2+、Ca2+、Fe2+)對乳源性金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響，結果顯示，Mg2+離子和有限濃度的Fe2+離子可以促進乳源性金黃色葡萄球菌生物被膜的生長。本試驗結果表明鈣離子能促進嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，而提高鎂離子濃度生物被膜的形成沒有顯著變化。鎂離子對生物被膜形成影響的差異性，推測是由于細菌種類的不同而產生的。

本試驗發現人纖維蛋白原對嗜水氣單胞菌生物被膜的形成有抑制作用，而對鏈球菌[13-14]、腸球菌[15-16]的生物被膜形成有促進作用。研究顯示纖維蛋白原對生物被膜形成的作用并不是對細菌增殖的影響[14]，而是有其他機制的存在。纖維蛋白原與細菌[17-18]及其表面吸附蛋白結合[19]，從而增強其吸附力，提高了生物被膜的形成能力。鏈球菌能合成纖維蛋白原表面結合蛋白[17]，為二者黏附的橋梁，推測嗜水氣單胞菌表面可能缺少這種蛋白，故纖維蛋白原不能促進其生物被膜的形成，至于抑制作用的原因還有待進一步的研究。

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