HR-ICP-MS定磷法在定量檢測DNA分子中的應用

李 妍， 李春華， 梁 文， 許 麗， 劉 剛

(上海市計量測試技術研究院 化學與電離輻射所, 上海 201203)

0 引 言

與傳統化學樣品相比，目前基因檢測的量值溯源水平有待提高，可溯源的DNA準確定量方法非常缺乏，無法滿足相關檢測過程中工作標準賦值、方法驗證、質量控制等的需求，影響了相關分析儀器的計量校準規程的建立。常用的定量DNA方法主要有紫外分光光度法(UV)、熒光染料法、qPCR(Quantitative PCR)、dPCR(Digital PCR)，前兩種方法在靈敏度和穩定性方面還有待提高[1]；后兩種方法存在假陽性的風險較大，而且對于以上DNA定量方法，量值溯源性問題仍然是很大挑戰。

隨著元素分析方法的發展，定磷法成為一種可行的DNA定量檢測方法，由于對于特定的DNA分子來說，其磷含量是一個固定參數，通過檢測DNA分子中的磷含量，就可以計算DNA分子的含量，該方法的靈敏度較高，可以溯源到國際單位，而且檢測成本較低。電感耦合等離子體發射光譜技術(ICP-OES)是一種溯源清晰的DNA定量方法[2], 韓國標準與科學研究院(KRISS)及美國標準與技術研究院(NIST)[3]等, 將該方法用于基因組核酸[4]、質粒DNA[5-7]和寡聚核酸[8-9]等核酸純品物質的定量測量。中國計量科學研究院也在核酸ICP-OES 定量分析方面做了大量的嘗試[10]。高分辨電感耦合等離子體質譜(HR-ICP-MS)定量的質量數能精確到0.000 1，其對痕量和超痕量元素良好的檢測能力以及譜圖的簡單易識，使其成為分析痕量和超痕量元素的常規方法[11-14]。

本文研究HR-ICP-MS定量檢測DNA中磷含量從而定量DNA的方法，考察純化和微波消解等樣品前處理步驟，考察生物實驗中常用的TE溶液對該方法的影響，對標準曲線的配制進行優化，保證檢測結果量值可溯源，且提高該方法與其它DNA定量方法的可比性。本方法具有良好的最低檢出限和精密度，可以應用于較低濃度質粒DNA標準物質的定值，符合相關技術文件要求[15-16]，有助于提高基因檢測領域的量值溯源水平，保證相關檢測項目的結果準確可靠。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：高純度硝酸(HNO3，10 mg/L，日本多摩化學)，磷酸二氫銨標準物質(GBW06502，中國計量科學研究院)，釔標準物質(GBW08657，中國計量科學研究院)，HR-ICP-MS測試試驗所用試劑均為分析純以上，實驗用水經超純水系統制備，所用器皿均經30%的硝酸浸泡，超純水清洗。Tris(生工生物公司)，EDTA(生工生物公司)，優級純鹽酸(國藥集團化學試劑有限公司)，脫氧核糖核酸酶I(寶生物公司)，異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司)，質粒提取試劑盒(OMEGA)、質粒純化試劑盒(德國MN公司)，NIST P標準物質(SRM3139a)，小牛胸腺DNA含量標準物質(中國計量院 GBW09801)，鮭魚精DNA成分標準物質(中國計量院BW2701-1)，轉基因大豆質粒DNA標準物質(上海計量院GBW(E)100274)。

儀器：Element2 高分辨電感耦合等離子發射光譜儀(美國Thermo公司)，MARS 微波消解儀(MILESTONE微波消解儀公司)，Millipore Q 超純水系統(美國Millipore 公司)，分析天平(瑞士梅特勒公司)，eppendorf高速冷凍離心機(德國eppendorf 公司)， nanodrop2000紫外分光光度計(美國Thermo公司)，電泳儀和電泳槽(美國伯樂公司)，凝膠成像分析系統(美國伯樂公司)，冷藏冰箱(海爾公司)，冷凍冰箱(海爾公司)，超低溫冷凍冰箱(美國Thermo公司)，立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)，恒溫混勻儀(德國eppendorf 公司)，渦旋振蕩器(德國IKA公司)，pH計(上海精科公司)，移液槍(德國eppendorf公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1TE溶液的配制

1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)：稱量121.1 g Tris置于1 L燒杯中，加入800 mL去離子水，充分攪拌溶解，調節pH值，定容至1 L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。

10×TE Buffer (pH7.4)：量取100 mL 1 mol/L Tris-HCl Buffer(pH7.4)，20 mL 500 mmol/L EDTA(pH8.0)置于1 L燒杯中，加入800 mL去離子水，混合均勻，定容至1 L，高溫高壓滅菌后，室溫保存。

1.2.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA純度

吸取2 μL質粒pXL02于1.5 mL EP管中，加入1 μL EcoRI核酸內切酶， 2 μL酶解緩沖液和15 μL無菌水，置于37 ℃水浴酶解2 h。取10 μL酶切液上樣0.8%瓊脂糖凝膠，電泳條件為電壓80～100 V、30 min，電泳后凝膠成像分析DNA條帶。

1.2.3樣品的微波消解

天平稱重空微波消解管質量記為mo，加適量的樣品于微波消解管中稱重記為mp，再加入適量2%硝酸溶液，微波消解條件為200 ℃，1 500 W，4 h；將消解后的微波消解管稱重質量記為mp；根據公式計算樣品的稀釋倍數

1.2.4計算樣品中磷元素的含量

根據基因測序測得DNA樣品的堿基數和相對分子質量，計算DNA樣品中P元素含量百分比：

wP%=堿基數×磷的原子量÷

DNA相對分子質量×100%

1.2.5HR-ICP-MS定磷法計算模型

根據定磷法原理，建立HR-ICP-MS檢測核酸濃度的計算模型：

式中：c為核酸樣品濃度；cs為由標準曲線求得樣品中P含量；Vs為檢測時樣品最終體積；V為吸取核酸樣品原液的體積；wP%為核酸樣品中P元素含量百分比。

將高濃度DNA樣品稀釋后用HR-ICP-MS檢測DNA樣品中磷元素的質譜信號豐度，再根據HR-ICP-MS檢測核酸濃度的計算模型得出DNA濃度。

1.2.6HR-ICP-MS定磷法和UV法的最低檢出限(LOD)

利用小牛胸腺DNA含量標準物質配制標準溶液，P濃度分別為1、2、3、4、5 ng/mL，用HR-ICP-MS對上述5種P標準溶液進行測定，計算標準曲線的斜率k。以DNA儲存液TE buffer為空白樣品，用HR-ICP-MS連續測量6次超純水和空白樣品的信號，計算標準偏差SD和 SDICP；根據公式計算：HR-ICP-MS定磷法檢測磷元素的最低檢出限

LODP=3SDICP/k

以wP%的DNA樣品為例，換算成HR-ICP-MS定磷法檢測DNA的最低檢出限

LODDNA=3SDICP/(0.1k)

核酸分子含有嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵，其紫外可見吸收光譜在260 nm附近有一強的吸收峰，針對雙鏈DNA，樣品濃度和吸光值之間有以下關系：

雙鏈DNA濃度=A260×50，其中A260為核酸在260 nm處的吸光值，單位為ng/μL。本項目中用TE buffer做空白樣品，用紫外分光光度計測量6次空白樣品在260 nm處的吸光值，計算標準偏差SDUV。UV法檢測DNA的最低檢出限

LODUV=3SDUV×50

1.2.7HR-ICP-MS定磷法的精密度

HR-ICP-MS定磷法測量轉基因大豆質粒DNA標準物質，連續測量8次，計算相對標準偏差，考察HR-ICP-MS定磷法的精密度。

2 結果與分析

2.1 樣品處理

以人工設計并合成的質粒DNA樣品(編號pXL02)為目標，開展HR-ICP-MS定量分析，并考察了前處理條件優化的必要性。質粒DNA樣品基因測序得到的基本信息如下：質粒名稱pXL02，堿基數4 266 bp，相對分子質量2 593 133 D，磷元素含量(質量分數)10.19%。

(1) DNA樣品的純度。用堿裂解法提取的質粒DNA樣品中?；煊屑毦蚪MDNA和RNA雜質，而HR-ICP-MS定磷法根據核酸中的磷定量，不能區分DNA和RNA。因此，保證樣品中不含有目標DNA外的核酸雜質，才能進行定磷法檢測。

將質粒DNA 樣品PXL02用限制性內切酶EcoRI 單酶切消化成線性片段，然后進行瓊脂糖凝膠電泳分析。由于質粒DNA 序列上有且僅有一個EcoRI酶切位點，環裝質粒DNA經過酶切消化后變成一條線性DNA(分子大小不變，仍為4 266 bp)。從圖1中可以看出清晰的DNA條帶，沒有細菌基因組DNA和RNA、蛋白質等雜質污染，滿足瓊脂糖凝膠電泳鑒定標準。理論上，高純度DNA樣品的A260/A280檢測結果應為1.8～2.0，而A260/A230檢測結果應達到2.0；本實驗中，經過純化后的樣品pXL02用紫外分光光度計檢測，A260/A280=1.9，A260/A230=2.0，滿足紫外分光光度法鑒定標準。表明，實驗室制備的質粒DNA樣品純度已經足夠高，沒有RNA污染，因此無需進一步增加純化步驟。

M-核酸標準片段DL 5 000 Marker; 1-PXL02 經限制性內切酶EcoRI 酶切后的產物

圖1 PXL02 電泳分析結果

(2) 微波消解的必要性。由于微波消解是HR-ICP-MS檢測樣品常用的前處理方法，因此，設計試驗考察質粒DNA樣品是否需要微波消解的前處理方法及其對檢測結果的影響。同樣的DNA樣品分成兩組，一組經過微波消解；另一組不經過微波消解，分別開展HR-ICP-MS檢測，數據如表1所示。結果發現，微波消解后的樣品HR-ICP-MS檢測信號降低9%，標準偏差增加32%。原因可能是低濃度的DNA在長時間的高溫微波消解過程中容易吸附在管壁上，導致部分DNA樣品損失，使樣品間檢測結果標準偏差增大。

表1 微波消解質粒樣品對HR-ICP-MS影響的統計檢驗

t-test統計分析微波消解和未微波消解質粒樣品濃度的檢測結果(表1)t(t-crit，說明兩種方法的實驗結果不存在顯著性差異。因此，微波消解DNA樣品的方法會降低質譜信號，并引入更多的質譜檢測信號標準偏差，但對檢測結果準確度沒有實質性影響。

因此，通過考察分析樣品的前處理條件，確定HR-ICP-MS定磷法定量DNA樣品的前處理過程無需進行微波消解，但需要鑒定樣品DNA純度，保證樣品中不含有目標DNA外的核酸雜質。

2.2 工作標準的選擇

考慮到DNA樣品的生物特殊性，用無機磷做標準曲線可能與實際DNA樣品有差異。因此，分別用無機磷標準物質和小牛胸腺DNA含量標準物質配制標準溶液，考察兩種標準曲線對HR-ICP-MS檢測DNA的影響。根據3次獨立試驗的標準曲線(見圖2)分析，小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線斜率小于無機磷標準物質配制的標準曲線。經過統計分析t-test統計結果見表2，兩種標準曲線的斜率存在顯著性差異。因此，小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線與無機磷標準物質配制的標準曲線有很大不同。

(a)

圖2 無機磷標準物質配制的標準曲線和小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線((a)～(c)分別表示在不同時間進行的3次獨立實驗，每次實驗每種標準曲線做3個重復)表2 無機磷和小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線差異統計分析

為進一步選擇適合檢測DNA的工作標準，將鮭魚精DNA成分標準物質作為被測樣品。HR-ICP-MS測量樣品依據無機磷工作標準曲線計算結果為843.37 mg/L，依據小牛胸腺DNA工作標準曲線計算結果為944.68 mg/L。鮭魚精DNA標準物質證書上標明其標準值為(968±38) mg/L，k=2。用小牛胸腺DNA工作標準計算得到的HR-ICP-MS測量結果符合標準值，而用無機磷工作標準計算得到的結果與比標準值明顯偏低12.9%。分析原因，認為在檢測核酸樣品時，DNA標準物質比無機磷標準物質與樣品具有更好基體一致性，HR-ICP-MS定磷法測量DNA樣品時應該選擇小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線作為工作標準。

2.3 靈敏度和精密度

利用儀器調試溶液對儀器進行各項參數的調試，儀器的最優化條件為：冷卻氣流量16.86 L/min，輔助氣流量0.99 L/min，霧化氣流量1.123 L/min，功率1 350 W。

以小牛胸腺DNA含量標準物質中磷的質量濃度為橫坐標(x)，質譜信號豐度為縱坐標(y)繪制標準曲線，如圖3所示，線性擬合度良好。

用HR-ICP-MS連續測量6次超純水和空白樣品，兩者質譜信號值差別很小，說明空白樣品中沒有干擾HR-ICP-MS檢測的元素。其中空白樣品的SDICP為35.06 cps。HR-ICP-MS定磷法的磷元素最低檢出限LODP為0.032 ng/mL，換算成HR-ICP-MS定磷法檢測DNA的最低檢出限LODDNA為0.000 32 ng/μL，UV法連續測量6次空白樣品的SD為0.002 Abs,檢測DNA的最低檢出限LODUV為0.3 ng/μL，可見HR-ICP-MS檢測DNA的最低檢出限優于紫外分光光度法3個數量級。因此，HR-ICP-MS定磷法檢測DNA的靈敏度更低，適用于定量低濃度DNA樣品。用HR-ICP-MS定磷法8次測量轉基因大豆質粒DNA標準物質，測量結果的相對標準偏差為2.15%，證明該方法精密度良好。

圖3 小牛胸腺DNA含量標準物質配制的標準曲線

2.4 HR-ICP-MS定磷法應用于標準物質的定值

在標準物質研制中，將HR-ICP-MS定磷法應用于阪崎腸桿菌檢測質粒DNA標準物質的定值。4個阪崎腸桿菌檢測質粒DNA標準物質(PXL04、PXL05、PXL06、PXL07)采用UV法和HR-ICP-MS定磷法2種方法定值；HR-ICP-MS檢測數據見表3。匯總全部原始數據后經統計檢驗確認各組數據無離群值、各組數據等精度、每組數據的平均值之間不存在顯著性差異后，取檢測結果的平均值為各質粒DNA 標準物質的標準值，分別為52.4，61.6，74.4，85.4 ng/μL。因此，HR-ICP-MS定磷法的精確度和靈敏度都能很好的滿足質粒DNA標準物質的定值，在今后研究中可以應用于質粒DNA標準物質的定值。

表3 HR-ICP-MS定磷法測量阪崎腸桿菌質粒DNA標準物質

3 結 語

本文通過實驗研究，建立了一種HR-ICP-MS定磷法定量檢測DNA分子的方法。該方法可作為常規制備DNA稀釋后直接定量檢測的標準物質定值方法，具有簡便快捷、靈敏度高、精密度好等優點，滿足DNA實際定量測量的應用需求。該方法重點攻克生物分析量值溯源領域的瓶頸問題，實現DNA分子HR-ICP-MS可溯源定值，推動DNA標準物質的研制工作，為生物檢測過程提供量值傳遞依據。

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