新疆部分地區致犢牛腹瀉輪狀病毒病的調查*

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003）

牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原之一，感染輪狀病毒的犢牛表現為消瘦、脫水、排蛋花狀水樣糞便，病情嚴重者常并發或繼發其他病毒、細菌、寄生蟲等感染[1]，導致規模化牛場犢牛死亡率升高[2]，目前輪狀病毒的檢測方法主要是病毒的分離鑒定[3-4]、RT-PCR[5-6]、半巢氏 RT-CR[7]、ELISA[8]等。張坤[9]等通過RT-PCR等方法對新疆北疆地區致犢牛腹瀉輪狀病毒病的調查發現，規模化牛場中犢牛存在感染。輪狀病毒結構蛋白中VP6蛋白構成輪狀病毒內衣殼[10]，具有良好的免疫原性和抗原性[11]。本研究利用VP6設計引物，運用RT-PCR和ELISA方法對新疆規模化牛場致犢牛腹瀉病原輪狀病毒病進行調查研究，以便為犢牛腹瀉采取防控措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑與儀器

ELISA雙抗體夾心檢測試劑盒購自上海潤裕生物技術有限公司，pMD19-T克隆載體、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自寶生物工程大連公司（Takara），RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司，2×Taq PCR MAsterMix溶液、DH5a菌株制備的感受態細胞均購自北京天根生物科技有限公司。試驗儀器主要有酶標儀、微量震蕩儀器和離心機（Costar公司）。

1.1.2 樣本采集

采集石河子地區奶牛場、石河子地區某肉牛場、昌吉奶牛場、奎屯地區奶牛場等地區腹瀉犢牛糞便共172份，于-80℃冰箱保存待檢。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將腹瀉犢牛糞便樣品與等體積的PBS于冰上充分研磨，進行超聲破碎，反復凍融，最后12 000 r離心30 min，取上清液用于PCR模板檢測和牛輪狀病毒ELISA試劑盒檢測。

1.2.2 牛輪狀病毒VP6基因的引物設計

根據GenBank公布的BRV基因序列VP6設計引物（見表1）。

1.2.3 總RNA的提取

按照說明書Trizol法，處理后的樣品加入適量的Trizol后，用無RNA酶槍頭反復吹打混勻，使樣品充分裂解，分離蛋白核酸復合物，靜置10 min后加入1/5 Trizol量的氯仿，震蕩混勻后靜置5 min，在預冷的4℃離心機中12 000 r離心15 min，EP管中的液體分為3層，提取的RNA主要在上層的無色液體中，利用特制的帶收集管的吸附柱，將無色液體和等量的無水乙醇全部加入吸附柱中，進行離心，用無RNA酶水進行洗脫收集得到的RNA，提取RNA后，進行反轉錄，具體反應體系如表2。

表1 牛輪狀病毒VP6基因PCR擴增引物信息

表2 反轉錄反應體系

1.2.4 PCR反應

PCR 反應體系 （20 μL）：2 × Es Taq Master mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應條件：95℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 個循環后，72℃延伸10 min。擴增反應結束后，將PCR產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，同時瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳和目的條帶回收

稱取瓊脂糖1.2 g、1×TBE電泳緩沖液60 mL，配置成2%的瓊脂糖凝膠溶液，經微波爐加熱，完全溶解，室溫靜置，滴加EB染液后充分混勻，將其倒入制膠槽中，約30 min后凝固，20 uL點樣，180 V、120 mA進行電泳，結束后將膠放入凝膠成像儀器中，進行拍照保存。

目的條帶的回收：用切膠刀將目的條帶在紫外燈下切除，置于無RNA酶的EP中加入適量的溶膠液，進行50℃水浴溶解，充分溶解后加入特制的吸附柱中，離心后，加入無水乙醇進行洗脫，最后用無RNA酶水進行洗脫，收集得到的洗脫液。

1.2.6 目的基因的連接（表3）

表3 目的基因的連接反應體系

1.2.7 轉化及菌液PCR鑒定

轉化按照說明書進行操作，采用經特殊工藝制作的DH5α感受態細胞進行DNA的熱激轉化，將連接產物加入置于冰上緩慢融化的DH5α感受態細胞中，用移液器吹打混勻后，置于冰上30 min，進行42℃水浴熱激90 s后迅速置于冰上，加入適量的LB液體后，37℃、170 r搖床上搖4 h，離心取沉淀涂于固體LB平板上。

菌液PCR的鑒定及測序：從轉化平皿中挑取單菌落加入氨芐抗性的LB液體培養基，37℃、180 r搖床培養4 h，進行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌，擴大培養后提取質粒送上海生工測序。

1.2.8 牛輪狀病毒抗原ELISA檢測

按照牛輪狀病毒抗原ELISA說明書進行。試劑盒原理是雙抗體夾心法，將處理好的樣品上清液吸取200 μL加入已經預先包被牛輪狀病毒捕獲抗體的微孔中，同時設置陰、陽性對照孔和空白孔，除空白孔外，樣品孔中加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100 μL，微量震蕩儀器上震蕩混勻，用封板膜封好后置于37℃恒溫培養箱中作用1 h，取出棄掉微孔中的液體，每孔用洗滌液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用終止液進行終止，在450 nm的酶標儀上進行讀數。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測的牛輪狀病毒感染情況

表4 新疆部分地區規模化牛場牛輪狀病毒檢測結果

經PCR方法對新疆部分地區規模化牛場172份腹瀉犢牛糞便樣品進行檢測，檢出陽性份數127份，陽性率73.83%（表4）。犢牛糞便中VP6基因檢測的結果（圖1、圖2）運用DNAMAN軟件將牛輪狀病毒VP6基因測序結果與標準序列進行在線比對，發現兩者同源性達到100%（部分圖）。

圖1 某規模化牛場腹瀉犢牛糞便輪狀病毒VP6基因檢測結果

2.2 ELISA檢測結果

表5 ELISA方法檢測結果

經ELISA方法對新疆部分地區規模化牛場172份腹瀉犢牛糞便樣品進行檢測，陽性份數100份，陽性率 72%（表5）。

圖2 牛輪狀病毒VP6基因與標準序列比對結果

3 討論

牛輪狀病毒VP6基因，是診斷牛輪狀病毒感染的常用基因，本研究通過設計牛輪狀病毒VP6基因引物，通過測序，將測序結果分別與牛輪狀病毒VP6基因標準序列通過DNAMAN軟件進行在線比對，發現擴增出的牛輪狀病毒VP6基因與標準序列的同源性為100%，可以判定被調查牛場犢牛遭受輪狀病毒病感染。

ELISA方法是進行大量樣本檢測的首選，本調查經ELISA方法對新疆部分地區規模化牛場腹瀉犢牛糞便樣品進行檢測，陽性率72%（100/172），經RT-PCR方法檢測犢牛糞便樣品，陽性率73.83%（127/172），這比張坤[9，12]等應用 RT-PCR 和 ELISA方法檢測報道的調查結果略高。綜合PCR和ELISA方法各自的優點，可對腹瀉犢牛的輪狀病毒感染提供較為準確的診斷。

參考文獻

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