銀屑病皮損FGF-1、MAPK1、CD34的表達與臨床特征的關系及意義

李 慶(天津市紅橋醫院皮膚科，天津 300131)

銀屑病是一種多基因遺傳背景下免疫介導的炎癥性皮膚病，其患病率約為0.1%～3%[1]。銀屑病主要病理表現為表皮角化過度伴角化不全，真皮乳頭層毛細血管擴張，炎性細胞浸潤明顯。銀屑病發生是以角質形成細胞異常增殖分化和血管增生為病理基礎。研究表明，成纖維細胞生長因子1(FGF-1)參與了組織器官發育、傷口愈合、腫瘤發生等過程[2]；絲裂原活化蛋白激酶-1(MAPK-1)信號通路在銀屑病的發生和進展過程中發揮重要作用[3]。CD34是血管內皮細胞中的分子標志物，它可反映血管新生情況[4]。本研究收集尋常型銀屑病皮損組織及正常皮膚組織，采用免疫組化法及反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)技術測定其中的FGF-1、MAPK1、CD34蛋白及mRNA表達水平，以探討三者在尋常銀屑病中的作用機制。

1 資料與方法

1.1一般資料：收集2015年7月～2016年10月在我院皮膚科接受治療的尋常型銀屑病患者34例的病變皮損作為標本，其中男18例，女16例；年齡17～40歲，平均(31.9±4.0)歲；靜止期12例，進行期22例；病程1～17年，平均(3.1±0.5)年。患者入院前未進行過系統或外用藥物治療，排除伴有系統性疾病患者。所有患者均進行銀屑病皮損面積和嚴重程度評分(PASI)。另外選擇同期在我院外科手術治療患者的正常皮膚組織34例作為對照，其中男17例，女17例；年齡18～42歲，平均(32.4±4.1)歲。上述所選患者均知情同意。銀屑病組與對照組患者的性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑：羊抗人FGF-1多克隆抗體由深圳寶凱侖科技有限公司提供；兔抗人MAPK-1多克隆抗體由上海領成生物科技有限公司提供；即用型兔抗人CD34多克隆抗體由上海滬峰化工有限公司提供；蠟塊RNA提取試劑盒由北京博邁斯科技發展有限公司提供；反轉錄及PCR試劑盒由深圳寶安康生物技術有限公司；免疫組化試劑盒由上海國源生物技術郵箱公司提供；磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸修復液、DAB顯色液由上海經科化學科技有限公司提供；二乙基焦磷酰胺(DEPC)由上海滬峰化工有限公司提供；其他試劑均由上海經科化學科技有限公司提供。

1.3方法

1.3.1RT-PCR檢測：采用蠟塊RNA提取試劑盒提取總RNA，檢測A260/A280值。加逆轉錄酶0.5 μl、引物0.5 μl、RNA 500 ng，5×RT緩沖液2 μl、,最后加無核酸水至10μl配制成10 μl逆轉錄反應體系，置于37℃ 15 min→98℃ 5 min進行反應。加2×Quick TaqHS Dremix 25 μl、引物1 μl、cDNA 5 μl，最后加無菌三蒸水至50 μl形成50 μl PCR反應體系，置于94℃預變性2 min→94℃變性30 s→Tm-5℃退火30 s→72℃終延伸10 min( 30個循環)。取10 μl獲得的RNA和2 μl緩沖液混合，加入含有0.5 μg/ml溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，以Tris硼酸緩沖液為電泳緩沖液，恒壓80 V，電泳1.5 h,用凝膠圖像成像分析儀拍片。測量A值、A值比值(即目的基因/β-actin)。

1.3.2組織芯片制備：以熔化石蠟制作空白蠟塊，制作8×7點組織陣列，用穿刺針打孔(內徑1.5 mm)。把供體蠟塊置于45℃烘10 min，用定位儀定位組織芯片后用穿刺針取出，并放入預備好的受體蠟塊內，每例取2個組織芯片。把做好的受體蠟塊組織包埋壓平，冷卻后置入72℃烘60 min,再把芯片置入冰箱內保存待用。

1.3.3免疫組化(SP)法測定：取備好的組織芯片連續切片(厚4 μm)，常規脫蠟，抗原修復，3%過氧化氫甲醇阻斷內源性過氧化物酶，加濃度1∶150的FGF-1、1∶100的MAPK-l和CD34，4℃冰箱內過夜。二抗根據試劑盒操作說明書完成。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍，脫水，透明，封片，鏡檢。以PBS代替一抗為陰性對照，以所購試劑附帶的銀屑病陽性組織為陽性對照。34例正常皮膚組織為正常對照。FGF-1、MAPK1、CD34表達于胞質，胞質染色呈淡黃色至棕黃色時判定為陽性。根據由兩人雙盲法觀察切片,選取≥5個高倍視野，≥1 000個細胞，對免疫組化結果進行評估。根據陽性細胞百分比和著色強度進行評分：0分：0%；1分：≤10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%，4分：>75%。著色強度:0分：不著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。根據陽性細胞百分比得分與著色強度得分之和判斷陽性強弱，陰性(-):0分；弱陽性(+):1～2分；陽性(++):3～5分;強陽性(+++):6～7分[4]。

2 結果

2.1FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相對表達情況：銀屑病組皮損FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相對表達水平明顯高于對照組，差異顯著有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA相對表達情況

2.2FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達情況：在銀屑病皮損和正常皮膚中均有FGF-1、MAPK1、CD34蛋白表達，表達率為100%，但正常皮膚多為弱陽性表達，而銀屑病皮損陽性和強陽性表達的比例明顯高于對照組，差異有顯著統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達情況[例(%)]

2.3FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達與臨床特征的關系：FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達與患者性別、年齡無明顯關系，差異無統計學意義(P>0.05)，進行期、PASI評分≥2.5的患者FGF-1、MAPK1、CD34蛋白強陽性表達明顯高于靜止期、PASI評分<2.5的患者，差異有顯著統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.4FGF-1表達與MAPK1、CD34、 PASI評分的關系：Spearman相關性分析顯示，FGF-1蛋白表達與MAPK-1蛋白、CD34蛋白呈正相關(r=0.723，0.649，P<0.05)，三者與PASI評分均呈正相關(r=0.724，0.685,0.617，P<0.05)。

表3 FGF-1、MAPK1、CD34蛋白陽性表達與臨床特征的關系[例(%)]

3 討論

銀屑病的基本病理改變為角質形成細胞過度增殖和血管異常增生。大量研究證實，銀屑病角質形成細胞的異常增殖、分化和凋亡是多種信號通路共同參與的一個過程[5]。在這些信號通路中，MAPK信號通路起著重要作用，它是一種絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白激酶，可把胞外刺激信號經級聯反應由胞膜傳入胞核，參與細胞的增殖、分化、凋亡等生理、病理過程。MAPK在人類皮膚中的表達與銀屑病的發生有顯著的關系。FGF-1是成纖維細胞生長因子成員之一，它廣泛表達于人類多種組織，也表達于表皮角質形成細胞、血管內皮細胞等[6]。FGF-1通過結合細胞表面受體FGFR-l而使其酪氨酸殘基磷酸化，同時誘發信號傳導級聯反應，啟動MAPK信號通路的下游激動因子Raf-1[7]。當細胞表面的FGFR-1識別FGF-1時會提高胞內的鈣離子和c-fos等mRNA水平,刺激原癌基因的表達，引起細胞過度增殖、分化[8]。

許多研究發現，CD34、CD31、vWF等是血管細胞內皮細胞表面的分子標志物，可用于血管新生的研究[9]。本研究以CD34來對血管新生進行評估。研究表明，銀屑病皮損中存在缺氧誘導因子-α、血管內皮生長因子等的高表達，而這些分子與微血管密度密切相關。FGF-l可誘導血管內皮生長因子高表達，促進血管新生，其機制可能是通過ERKl/2和P38MAPK信號通路實現。故認為，FGF-1是經非經典分泌方式出胞，在通過細胞表明受體介導的內吞作用進入胞內，同時與胞膜上的絡氨酸磷酸化位點結合而發揮信號傳遞作用，從而使DNA合成增加，促進細胞增殖分化，加速真皮血管的新生，這對銀屑病的發生起著重要作用。

本研究結果顯示，銀屑病皮損中FGF-1、MAPK1、CD34 mRNA的相對表達水平及其蛋白強陽性表達率明顯高于正常皮膚，差異有統計學意義(P<0.05)，FGF-1、MAPK1表達上調表明，二者可能參與了銀屑病的發生，而CD34表達生則表明真皮乳頭層存在血管新生；進一步研究發現，進行期、PASI評分≥2.5的患者表達水平更高，說明三者的表達水平與臨床分期及嚴重程度有關，相關性分析則顯示三者間呈正相關，且均與PASI評分呈正相關，因此對三者的檢測可評估銀屑病的嚴重程度及預后。

綜上所述，銀屑病皮損存在FGF-1、MAPK1、CD34表達上調，FGF-1、MAPK1可能在銀屑病皮損角質形成細胞異常增殖和血管異常新生中起重要作用，且其表達水平與疾病嚴重程度有關，對其檢測利于評估疾病的嚴重程度及預后。

4 參考文獻

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