MSCT全腫瘤灌注參數與結直腸癌臨床病理分期及MVD、EGFR水平的相關性分析

楊璧　潘恒　蔡勇

【摘要】 目的：探討多層螺旋CT（MSCT）全腫瘤灌注參數與結直腸癌臨床病理分期及腫瘤微血管密度（MVD）、表皮生長因子受體（EGFR）表達水平的相關性。方法：選取2014-2017年在本院就診且進行MSCT全腫瘤灌注的42例結直腸癌患者為研究對象，記錄患者灌注參數[血容量（BV）、血流量（BF）、達峰時間（TTP）、表面通透性（PS）]，根據病理診斷結果患者進行臨床病理分期，并按照免疫組化步驟檢測腫瘤樣本中MVD及EGFR表達情況，采用Person相關性分析或Spearman相關性分析檢測灌注參數與其他指標的相關性。結果：根據病理結果，TNM Ⅰ期6例、Ⅱ期7例、Ⅲ期14例、Ⅳ期15例；且TNM分期與BF、TTP、PS均具有一定相關性（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035）；此外MVD及EGFR與以上各參數均無明顯相關性（P>0.05），但MVD與EGFR之間存在一定相關性（r=0.433，P=0.043），同時EGFR陰性組與陽性組BF、TTS表達比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：MSCT全腫瘤灌注參數與臨床病理分期具有較好的相關性，而MVD及EGFR的相關性較差，因而較適宜作為臨床病理特征分析的輔助指標。

【關鍵詞】 全腫瘤灌注； 結直腸癌； 血管生成

Correlation Analysis of MSCT Whole Tumor Perfusion Parameters with Clinicopathologic Stage and MVDD and EGFR Levels in Colorectal Cancer/YANG Bi，PAN Heng，CAI Yong.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：009-013

【Abstract】 Objective：To investigate the relationship between the perfusion parameters of multislice CT（MSCT） and clinical stage，colorectal cancer，microvessel density（MVD） and epidermal growth factor receptor（EGFR） expression in colorectal cancer.Method：From 2014 to 2017，42 patients with colorectal cancer treated with MSCT whole tumor perfusion were selected as study subjects.The perfusion parameters[blood volume（BV），blood flow（BF），peak to time（TTP） and surface permeability（PS）] were recorded.The expression of MVD and EGFR in tumor samples were detected according to the immunohistochemical method.The correlation between perfusion parameters and other indexes were analyzed by Person correlation analysis or Spearman correlation analysis.Result：According to the pathological results，there were 6 cases in TNM stage Ⅰ，7 cases in TNM stage Ⅱ，14 cases in TNM stage Ⅲ and 15 cases in TNM stage Ⅳ.There was a certain correlation between TNM stage and BF，TTP，PS（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），in addition，there was no significant correlation between MVD and EGFR with the above parameters（P>0.05），but there was a correlation between MVD and EGFR（r=0.433，P=0.043）.Meanwhile，the difference between EGFR negative group and positive group was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The correlation between MSCT whole tumor perfusion and clinicopathologic stage is better than that between MVD and EGFR，so MVD and EGFR are more suitable for an auxiliary index for clinical pathological analysis.

【Key words】 Whole tumor perfusion； Colorectal cancer； Angiogenesis

First-authors address：Xinyi Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyi 525300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.003

目前，結直腸癌是我國消化道腫瘤中發生率及死亡率均較高的惡性腫瘤之一[1-2]。隨著對腫瘤微環境的深入研究發現，人們發現腫瘤新生血管的生成是導致結直腸癌患者發生腫瘤增殖及轉移的重要因素之一，而給予患者抗血管生成藥物治療后，患者生存率有明顯提高[3-4]。因此，對于可反應腫瘤血管生成能力指標如腫瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）或表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等水平的檢測越來越受到醫務科研人員的重視[5-7]。而得益于多層螺旋CT（multislice CT，MSCT）灌注成像技術快速發展，使過大醫務工作者可以間接了解患者機體腫瘤血供及血管生成情況。但是，如何將灌注參數與腫瘤血管生成能力及患者預后情況結合起來一直是研究的重點及熱點問題。因此，本文對42例在本院就診且實施MSCT全腫瘤灌注的結直腸癌患者臨床資料進行分析，并結合其臨床病理分期和MVD、EGFR水平，以期望能對MSCT技術的高效應用提供有力證據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月-2017年9月在本院胃腸外科接受結腸鏡檢查，并經病理確診的42例結直腸癌患者臨床資料。納入標準：（1）經病理診斷確診為結直腸腺癌；（2）MSCT全腫瘤灌注前未采取抗腫瘤治療；（3）無肝、腎、心等重要臟器病變；（4）不合并其他慢性消耗性疾??；（5）完成手術，且有完備的隨訪資料。排除標準：（1）預計生存期小于6個月者；（2）患者躁動，無法配合檢查者。本研究經本院倫理委員會批準，所有參與研究的患者知情并簽署知情同意書。

1.2 CT檢查

1.2.1 掃描前準備 檢查前6 h禁食，清空腸道。檢查前10～15 min肌肉注射鹽酸消旋山崀菪堿（批準文號：H41023400，生產廠家：國藥集團容生制藥有限公司）10 mg。經Foleys導尿管從肛門注入生理鹽水，至患者略感不適時停止，1 000～1 500 mL。上檢查床后，要求患者采取平靜呼吸，并用腹帶輔助抑制患者腹式呼吸。

1.2.2 灌注方法及相關參數 患者取仰臥位，采用64層CT掃描機（德國 Siemens）對腹盆部進行CT平掃，選擇病變最大層面為灌注區域，進行Jog模式下的全腫瘤灌注掃描。按6 mL/s流速經患者肘前靜脈注入碘普羅胺注射液（批準文號：H20030506，生產廠家：Bayer Schering Pharma AG）50 mL，延遲10 s后即可開啟灌注掃描模式，持續時間60 s，管電壓100 kV，管電流100 mA。

1.2.3 圖像分析及處理 掃描圖像均傳至Siemens工作站（德國 Siemens），由兩名影像醫師應用Body Perfusion軟件自帶的Tumor Perfusion程序處理及分析掃描圖像。選擇感興趣區時壓避開血管及腫瘤邊緣區、腫瘤壞死區。灌注圖像由Siemens工作站中Tumor Perfusion軟件采用是非去卷積算法計算灌注各參數。所有圖像均顯示為彩色，并以多次測量后取平均值為該病最終灌注參數數值。軟件生成的灌注參數值：（1）血容量（blood volume，BV），反映腫瘤組織血管生成情況，單位mL/100 g；（2）血流量（blood flow，BF），反映單位時間流經腫瘤組織血管中的血量，單位mL/（min·100 g）；（3）達峰時間（time to peak，TTP），反映癌組織內部灌注壓力，單位s；（4）表面通透性（permeability surface area product，PS），反映單位時間內，對比劑由從組織毛細血管擴散至細胞間隙的傳輸速率，單位mL/（min·100 g）。

1.3 臨床病理分級 依據病理結果及參考文獻[8]進行TNM分期。T0：未見原發腫瘤灶；T1：腫瘤僅見于黏膜、黏膜下層；T2：腫瘤浸潤至肌層；T3腫瘤浸潤至直腸周圍脂肪組織；T4：腫瘤侵犯其他器官。N0：無區域性淋巴轉移；N1：1～3個區域性淋巴結轉移；N2：存在4個以上的區域性淋巴結轉移。M0：無遠處轉移，M1：存在遠處轉移。

1.4 標本采集及免疫組化檢查 手術切除患者腫瘤組織后，在腫瘤近端處1～2 cm多點取材，經10%福爾馬林溶液固定后，按照常規步驟進行石蠟包埋，并切成厚度為5 μm切片。按照免疫組化試劑盒步驟測定MVD數量和EGFR表達量。以被CD34染色成孤立的棕黃色內皮細胞或內皮細胞團認為1個微血管，先以低倍鏡選擇微血管數量最多區域后，轉換至高倍鏡下，隨機挑選10個視野，所得均值即為MVD值。EGFR染色依據參考文獻[9]評分標準：A為染色細胞占視野下總細胞數比例。按照細胞染色比例<1%（0分），1%～10%（1分），11%～50%（2分），51%～80%（3分），>80%（4分）；B為細胞染色強度，按照陰性（0分），弱陽性（1分），陽性（2分），強陽性（3分）。最后得分依據A×B得分計算，總分0分（-），1～4分（+），5～8分（++），9～12分（+++）。其中將（-）、（+）視為陰性表達，（++）、（+++）視為陽性表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計分析軟件處理數據。計量資料按照（x±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。灌流參數與臨床病理分期、MVD、EGFR相關性分析采用Person相關性檢驗或Spearman相關性檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 42例結直腸癌患者，男28例，女14例；平均年齡（62.4±10.3）歲；腫瘤位置：乙狀結腸6例、升結腸5例、橫結腸2例、降結腸3例、直腸26例。

2.2 臨床病理特征與灌流參數相關性分析 病理結果顯示，42例患者中處于Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期14例，Ⅳ期15例。由相關性分析結果可知，BF、TTS、PS與腫瘤TNM存在一定相關性（rBF=

-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），即灌流參數BF數值越低、TTP與PS值越高，患者TNM分期則越高，同時BV與腫瘤TNM分期無明顯相關性（rBV=-0.134，P=0.432），見表1。

2.3 MVD與灌流參數相關性分析 低倍鏡下清晰可見被染成棕黃色或棕褐色內皮細胞或內皮細胞簇，在200倍鏡下觀察，42例結直腸癌患者MVD平均為（30.13±8.45），但由于所選切面差異，部分微血管結構并不明顯，可呈管腔狀。經Person相關性分析可知，MVD與全腫瘤灌注參數BV、BF、TTP、PS均無相關性（r=0.187，P=0.245；r=0.292，P=0.085；r=-0.146，P=0.314；r=-0.152，P=0.218），見圖1。

2.4 EGFR與灌流參數相關性 免疫組化結果顯示，共18例為陰性，24例為陽性，見圖2。此外，相關性結果顯示，EGFR與BV、BF、TTP及PS均未有明顯的相關性（r=0.194、0312、-0.188、-0.238，P=0.312、0.363、0.294、0.324），但EGFR與MVD呈現一定成相關性（r=0.433，P=0.043）。同時，EGFR陰性組與陽性組BF、TTP、MVD比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

結直腸癌是我國較為常見且復發率較高的消化道腫瘤之一。目前研究已證實，腫瘤新生血管為結直腸癌的復發及轉移提供了必要的條件，而這同樣是造成腫瘤難以根治的主要原因。因此，采取一種快速、準確的評價指標來預測腫瘤新生血管能力具有重要意義。其中，MVD正是反映腫瘤新生血管生成能力的重要參數之一。其主要方法為通過免疫組化法檢測手術切除后腫瘤組織中的MVD值，并以此來推測腫瘤內血管生成能力。該方法雖然在一定程度上反映了局部腫瘤血管生成能力，但由于取材部位、染色方法、計數誤差等，往往存在重復性差的問題，從而對最終結果的判斷造成影響。與此同時，隨著醫療技術的快速發展，采用MSCT全腫瘤灌注來評估術前腫瘤血管生成能力已逐漸被臨床工作者認同。García Figueiras等[10]曾對24例結直腸癌患者全灌注參數及MVD值進行相關性分析，其結果顯示兩者間存在一定的相關性。但隨后Cros等[11]則提出全灌注參數與MVD并無明顯相關性，但卻能對腫瘤臨床分期具有一定預測作用。筆者猜測，造成兩種不同結果的原因，除了所篩選的病例數差異外，更為重要的是腫瘤內血管生成存在不均一性，而這導致了MVD并不能很好的反應腫瘤組織整個血管生成情況，因而無法與全灌注參數進行系統比較。

本文通過增大病例數，即將病例數增多至42例，除了比較患者臨床分期與灌流參數相信外，還采用特異性較強的CD34抗體染色腫瘤血管后計算MVD值。此外，本研究還增加了對EGFR的檢測。以往研究證實EGFR可通過與配體結合促發下游級聯信號通路，如PI3K-Akt及RAS-RAF-MAPK通路，并最終參與細胞增殖、分化、遷移及細胞損傷一系列過程[12-14]。此外，大量研究報道稱在結直腸癌患者癌組織中存在EGFR高表達，且EGFR具有促進血管生成及抑制細胞凋亡的作用[15-16]。因此，通過以上各指標分析，有助于進一步了解全腫瘤灌流與血管生成的相關性。

本研究結果顯示，灌流參數中BF、TTP、PS與腫瘤TNM存在相關性（rBF=-0.683，P=0.023；rTTP=0.632，P=0.035；rPS=0.654，P=0.035），而BV則與腫瘤TNM分期無相關性。而對TNM分期各指標進一步研究發現，無論腫瘤浸潤程度，是否發生淋巴結轉移及是否有遠處轉移，其灌流參數中的BV均未見明顯差異，而當腫瘤分期靠后，出現淋巴結轉移或遠端轉移時，其BF下降、TTP及PS均增殖。其結果基本與Fraioli等[17]相符合。由于分期較晚的腫瘤患者，其內部可供腫瘤生存空間有限，組織內壓力增加，使得毛細血管受壓，減慢了血流速度，從而延長了達峰時間。此外，由于血流量不足與腫瘤高度耗氧的矛盾存在，使腫瘤細胞具有更好的侵襲及轉移能力[18]。

此外，本文進一步確認了全腫瘤灌注參數與MVD之間并無顯著相關性?？赡茉蚴悄[瘤組織內血管分布相對失衡，并具有一定的向心性遞減趨勢；同時，全腫瘤灌注成像較適用于分析成熟血管狀況，但對于孤立的或未成熟的血管無法有效鑒別[19]。而CD34抗體則可對新生血管，未成熟血管等進行標記染色，從而導致數據有一定偏差。此外，本文發現雖然EGFR與全腫瘤灌注參數無明顯相關性，但EGFR陰性組與EGFR陽性組在BF及TTP平均值上存在差異。目前，作為胃腸道腫瘤進展及耐藥的關鍵分子，EGRF已成為時下較為有效的藥物靶點。研究顯示EGRF除了參與調控細胞周期外，還可以通過調節VEGF、Ang-1等因子水平來影響腫瘤血管的生成[20]。而筆者發現，EGFR與MVD存在一定的相關性。而這可能是EGFR同樣存在于未成熟內皮細胞及新生血管附近，從而在數據采集上與MVD基本一致。

綜上所述，MSCT全腫瘤灌注與結直腸癌TNM臨床病理分期具有較好的相關性，可作為預測臨床病理特征的有效指標，但MSCT全腫瘤灌注與MVD及EGFR相關性較弱。但鑒于本次納入病例數較少，且缺乏中長期隨訪結果，因此若要獲得更為確切可靠結論，仍需進一步擴大樣本，并增加術后隨訪。

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（收稿日期：2017-12-22） （本文編輯：程旭然）