TET2蛋白下調5hmC在膀胱癌細胞T739中低表達

謝梅茂　王忠軍　胡映秋

【摘要】 目的：研究膀胱尿路上皮癌細胞中TET2蛋白及5hmC的表達量相關作用。方法：采用Real-time PCR檢測正常尿路上皮細胞和膀胱尿路上皮癌細胞中TET2 mRNA的表達，并同時采用細胞免疫化學染色檢測正常尿路上皮細胞和膀胱尿路上皮癌細胞中5mC及5hmC表達，了解TET與膀胱癌的作用關系，并探討其可能的作用機制。結果：TET2 mRNA在正常膀胱細胞T24中的表達（1.400 00±0.057 74，n=3），顯著高于膀胱癌T739細胞[（0.866 70±0.120 20，n=3），P=0.016 1]；TET2蛋白在T739中表達（1.589 00±0.048 52，n=3）也明顯低于T24[（1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7]。5-mC在兩種細胞中的表達量比較差異無統計學意義（P=0.097 6）；5-hmC的表達量T739細胞明顯低于T24細胞

[（1.840 00±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1）]。結論：TET2 mRNA和蛋白水平在膀胱腫瘤細胞中低表達，顯著低于正常膀胱細胞；且TET2與5hmC低表達存在相關性。

【關鍵詞】 TET2； 5hmC； 膀胱癌

TET2 Protein Downregulates Low Expression of 5hmC in Bladder Cancer Cell T739/XIE Meimao，WANG Zhongjun，HU Yingqiu，et al.//Medical Innovation of China，2018，15（08）：036-039

【Abstract】 Objective：To study the expression of TET2 protein and 5hmC in bladder urothelial carcinoma cells.Method：Real-time PCR was used to detect the expression of TET2 in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells mRNA，and at the same time immunohistochemical staining was used to detect 5mC and 5hmC in normal urothelial cells and bladder urothelial carcinoma cells，TET and bladder cancer，and its possible mechanism of action was explored.Result：The expression of TET2 mRNA in normal bladder cells in

T24（1.400 00±0.057 74，n=3），was significantly higher than that of T739 cells of bladder cancer[（0.866 70

±0.120 20，n=3），P=0.016 1].The expression of TET2 protein in T739 was significantly lower than that of T24[（1.589 00±0.048 52，n=3） VS （1.310 00±0.049 33，n=3），P=0.015 7].There was no significant difference in the expression level of 5-mC between two kinds of cells（P=0.097 6）.The expression level of 5-hmC was significantly different，and the T739 cell group was significantly lower than that of T24 cell group[（1.840 00

±0.055 68，n=3） VS （1.487 00±0.041 77，n=3），P=0.007 1].Conclusion：TET2 mRNA and protein levels are low expression in bladder tumor cells，significantly lower than those of normal bladder cells，and there is a correlation between the low expression of TET2 and 5hmC.

【Key words】 TET2； 5hmC； Bladder cancer

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.08.009

隨著相關診療技術的進展，膀胱癌的發病率與病死率在我國呈現逐年升高趨勢，嚴重地危害著我國居民健康[1]。75%～85%初診膀胱癌患者為非肌層浸潤性腫瘤，經尿道手術治療后，約20%進展為肌層浸潤性膀胱癌，患者需行根治性手術切除膀胱，生活質量與預期壽命均顯著下降[2]。膀胱癌是由多因素綜合作用導致的，一個復雜的病理過程，與遺傳、環境、免疫等密切相關。在腫瘤轉移發生過程中，許多基因的表達將出現改變，尤其是腫瘤可通過上調轉移促進基因（metastasis-promoting genes）的表達以及下調轉移抑制基因（metastasis-suppressor genes）的表達來獲得一些新的生物學特性，從而增強腫瘤細胞的侵襲及轉移能力[3]。隨著表觀遺傳學的研究進展以及檢測方式的改進，5?羥甲基胞嘧啶（5-Hydroxymethylcytosine，5hmC）逐漸成為目前的研究熱點。5hmC是由TET蛋白催化5?甲基胞嘧啶（5-Methylcytosine，5mC）去甲基化轉化而來。近年來，人們對這一有趣的DNA研究有了很大的興趣，了解TET蛋白和5hmC的相關性，進一步了解基因調控與疾病的關系。5hmC水平表達可能在各個方面發揮著重要作用病理生理過程，如血液學惡性腫瘤、黑色素瘤、神經退行性疾病和老化等[4-7]。然而，5hmC是否與膀胱腫瘤相關，目前尚無明確報道。本研究，擬通過檢測膀胱癌細胞及正常膀胱上皮細胞中TET2及5hmC的表達，了解膀胱尿路上皮癌發生發展過程中TET家族可能所起的作用，并探討其可能的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源及培養 人類膀胱癌細胞株T739、人膀胱上皮細胞株T24由中科院上海細胞庫提供。RPMI 1640細胞培養液購自Hyclone公司，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素購自Invitrogen公司。細胞置于培養皿中，放到37 ℃的條件下，5%CO2培養箱中傳代培養。最終，取對數生長期的細胞進行本研究的相關實驗操作。

1.2 RNA提取、反轉錄聚合酶鏈反應 Real-time PCR檢測T739和T24細胞中TET2 mRNA的表達，利用TRIzol試劑（Invitrogen公司）分別提取T739與T24細胞的總RNA，合成cDNA。反應條件：（1）42 ℃ 30 min；（2）99 ℃5 min，反應產物-20 ℃冰箱保存。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，合成cDNA，進行real-time PCR反應。本研究中采用的TET2 mRNA的引物序列由上海生工生物工程公司合成：上游5-TTCTTCCCCATGACCAC-3下游5-ACGCTTGGAAG CAGGAGAT-3。PCR循環條件：（1）變性94 ℃ 30秒；（2）退火55 ℃45秒；（3）延伸65 ℃45秒，共循環30次；（4）72 ℃延伸5 min。分析最終的基因擴增結果，計算Ct值。采用GAPDH作為內參。每組設3個復孔，基因相對表達量（RQ）采用2-△△Ct方法計算。

1.3 蛋白質印跡法檢測TET2蛋白表達量 采用

1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF，凱基生物科技有限公司，Ltd，南京，中國）于冰上孵育0.5 h，裂解細胞。使用BCA蛋白檢測試劑盒（凱基生物科技有限公司）檢測蛋白濃度。細胞裂解液（16 μg）用6%十二烷基硫酸鈉處理。聚丙烯酰胺凝膠電泳，PVDF轉膜。采用含5%脫脂牛奶的TBST，室溫封閉1 h。加入一抗，抗TET2（1∶500稀釋，Abcam，美國）在4 ℃過夜。TBST洗滌后，印跡與二抗體孵育（1∶6 000稀釋，cwbio）在室溫下1 h。蛋白質密度分析Image J軟件（美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州，美國）

1.4 細胞免疫化學染色檢測5mC和5hmC表達 T739與T24細胞去除培養基后，采用PBS沖洗3次，5 min/次。PBS清洗后，收集細胞放置于4%多聚甲醛，37 ℃固定15 min。固定后，再用PBS清洗細胞3次，5 min/次。將細胞置入預冷的甲醇處理10min，處理前甲醛需要置于-20 ℃冰箱預處理。PBS洗3 次。孵育一抗：5hmC為1∶500，Abcam，美國，4 ℃孵育過夜。一抗孵育后，PBS洗滌細胞，5 min/次，洗3次。孵育熒光二抗。兩種抗體，抗體稀釋度：AlexaFluor594為1∶800，AlexaFluor488為1∶400。二抗室溫孵育，孵育60 min。PBS清洗后，用50%甘油/PBS封片觀察。采用尼康熒光顯微鏡進行觀察。采用Image ProPlus Version 4.0軟件分析，檢測熒光光度值。

1.5 統計學處理 以上實驗均重復3次以上。統計學軟件采用SPSS 19.0版（SPSS Inc.，Chicago，IL，美國），實驗結果用（x±s）表示，先進行方差分析（F檢驗），兩樣本均數比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測TET2 mRNA的在T739和T24細胞的表達水平 TET2 mRNA在T739中的表達（1.400 00±0.057 74，n=3），顯著高于T24細胞（0.866 70±0.120 20，n=3），差異有統計學意義（P=0.0161），見圖1。

2.2 TET2 蛋白的在T739和T24細胞的表達水平 TET2蛋白在T739細胞中的表達為（1.589 00

±0.048 52，n=3），T24細胞為（1.310 00±0.049 33，

n=3），TET2蛋白在T739細胞中的表達明顯高于T24細胞（P=0.015 7），見圖2。

2.3 5mC和5hmC在T739和T24細胞的表達水平比較 5mC在T739和T24細胞的表達水平比較，差異無統計學意義（P=0.097 6），見圖3；5hmC在T739細胞中的表達（1.840 00±0.055 68，n=3）明顯高于T24細胞（1.487 00±0.041 77，n=3），差異有統計學意義（P=0.007 1），見圖4。

3 討論

5hmC是由TET家族蛋白催化產生的氧化產物，早在幾十年前就被發現[8]。但是直到最近，研究者才在鼠的腦和胚胎干細胞中確定了5hmC的高表達，羥甲基話逐漸被人們所重視[9]。目前研究認為，5hmC是去甲基化的中間產物，通過移位或突變產生甲基化表型，從而破壞了TET蛋白質的功能。TET蛋白是5hmC的重要調節因子[10]。人TET蛋白家族共有3個成員，分別為TET1、TET2和TET3。TET1主要在胎兒組織和干細胞中表達，TET2在造血系統中含量較高，而TET3則在結腸和肌肉等組織中表達[11]。其中，TET2相關研究顯示：約有20%骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者可以被檢測出TET2突變；并且，相關結果與臨床癥狀存在一定的相關性；有部分學者認為：TET2可以被作為一種良好的診斷標志物，指導精準治療[12-13]。

在人類的不同組織中，5hmC表達存在明顯的差異性。采用免疫沉淀等方法，Li等[14]發現在人腦組織中5hmC高表達約0.67%，在肝、腎、結直腸組織中表達量相對較低，在心、乳腺、胎盤組織內表達量更低，僅為0.05%～0.06%。本研究發現但去甲基化5mC即5hmC在腫瘤細胞中，也存在高表達的趨勢。相對于T24的表達量，TET2作為5hmC的重要調節因子，在腫瘤細胞T739中mRNA和蛋白水平均明顯降低，這與腫瘤與低甲基化水平相類似的結果。DNA甲基化，是最早被學者發現的表觀遺傳的修飾形式。TET2基因維持CpG島的局部DNA甲基化，從而起到了阻止腫瘤細胞CPG異常甲基化的作用[15]。

最近的一項報告顯示，腦部病變，特別是星形細胞瘤和膠質母細胞瘤，隨著腫瘤級別升高，5mC水平沒有明顯變化，但可以顯著降低5hmC[16]；其他的研究也顯示，相比于正常組織，腫瘤會降低5hmC的水平[17-18]。國內的一些學者在其他實體癌的相關研究中，也得到了相類似的結果：謝素紅等[19]通過應用小干擾RNA沉默TET1基因表達，可顯著下調腎癌786-O細胞中TET1蛋白的表達水平，明顯抑制786-O細胞的增殖，并使細胞阻滯于G1期，其機制可能與TET1調控SUZ12的表達，影響其靶基因對PRC2的招募有關。可能的猜想是：TET2突變導致活性喪失或功能丟失，阻止了5mC向5hmC轉化，從而造成5hmC的降低，但由于體內其他代謝途徑維持了5mC的平衡[20]。所以本研究中膀胱癌細胞中5hmC顯著降低，但與正常細胞相比5mC水平無明顯變化。

到目前為止，TET2蛋白是否在實體惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用仍有待進一步研究。雖然本研究發現了TET2、5hmC在膀胱腫瘤細胞中的高表達，提示TET2和5hmC可能成為膀胱癌診斷及治療的新靶點，為了解膀胱尿路上皮癌發生發展過程中TET家族可能所起的作用，但具體相關機制尚需要進一步深入研究。

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（收稿日期：2017-11-30） （本文編輯：程旭然）