蜜環菌發酵生產胞外漆酶的工藝優化

（天津天獅學院生物與食品工程學院，天津 301700）

蜜環菌（Amillariella mellea）是一種藥食兩用真菌，多作為藥材天麻的伴生菌。工業化生產多采用液體深層發酵技術[1]，發酵液中富含多種活性成分，以蜜環菌液態發酵產物開發出的眾多商品[2]。漆酶（EC 1.10.3.2）是蜜環菌發酵液中積累的一種綠色環保型多酚氧化酶，其活性中心含有金屬離銅，可以催化酚類及芳胺類物質的聚合、降解及轉化，近年來在在工業、農業、食品[3]、廢水處理[4-5]和醫藥[6]等領域市場前景廣闊[7]。

以深層液態發酵培養可以提高漆酶的產率，許多學者致力于研究漆酶生產的發酵條件。司靜等[8]分別以麥芽糖和蛋白胨作為碳源和氮源，篩選出漆酶高產菌株為東方栓孔菌Trametes orientalis Cui. 6300，一定程度上縮短漆酶生產周期。徐雪霏等[9]對黃多孔菌發酵產漆酶的條件進行優化，提高酶活2.5倍，發現影響該菌產生漆酶的主要營養因素為碳氮比。實驗證明漆酶發酵較適pH多集中在4.0～6.0，不同的真菌有它們各自的最佳pH，且底物不同，最適發酵pH也差異明顯[10-12]。目前，漆酶的研究還在探索，很多方面需要完善，對漆酶發酵的研究暫時還主要在實驗室中進行，產漆酶培養基的優化和大規模生產是將來發展的趨勢，漆酶的價值會緊跟著科技時代的步伐，慢慢地被世人所熟知。

本研究利用實驗室培養保存的蜜環菌進行發酵培養，改變培養條件，測定發酵液中漆酶的活性，對蜜環菌產漆酶的發酵工藝進行優化，旨在找出適宜大批生產的操作方案，為企業提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

蜜環菌A9，購于華中農業大學菌種實驗中心，經天津天獅學院生物工程實驗中心擴大培養用于試驗。

1.1.2 試驗試劑

葡萄糖、可溶性淀粉、2,2′-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（簡稱ABTS，Sigma-Alorich生產）等，購于上海藍季科技發展有限公司；七水硫酸鎂、氯化鈣、氯化銨、硝酸銨、牛肉膏、蛋白胨等，購于天津市風船化學試劑科技有限公司；玉米粉、麥麩，購于農貿市場。

1.1.3 儀器設備

恒溫培養搖床HNY-200B，天津歐諾產；臺式高速離心機TG16K-II，長沙東旺產；賽多利斯天平BSA124S，德國產；高壓蒸汽滅菌鍋MJ-78A，上海施都凱產；紫外可見分光光度計UV1000，上海天美產；超凈工作臺SW-CJ-2G，蘇州凈化產。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗培養基的制備

將1 L去離子水倒入電磁爐中，分別加入80 g麥麩，200 g馬鈴薯小塊，大火煮沸后溫火煮20 min，8層紗布過濾，用去離子水補足溶液至1 L。分別添加1.5 g MgSO4·7H2O、2 g KH2PO4、0.1 g CaCl2，0.01 g 維生素B1，用氫氧化鈉和檸檬酸調整培養液的pH至6.0作為基本培養基。

公式中Kjaccard和Ksorensen為科、屬、種相似性系數，A、B分別為兩地區植物科、屬、種數，C為兩地區共有植物科、屬、種數。

根據研究目的不同，在基本培養基中添加不同葡萄糖和蛋白胨分別作為碳源和氮源，添加一定量的微量元素，微量元素溶液見表1。

表1 微量元素溶液成分表

1.2.2 液體菌種制備及接種培養

將蜜環菌斜面菌種接種到綜合PDA平板上25 ℃黑暗培養活化14 d。在超凈臺下，用打孔器取長勢一致的菌絲，接種于液體培養基中，25 ℃、180 r/min搖瓶培養7 d，收集菌絲體懸液作為液體菌種。接種時，在超凈臺下用取液器精確吸取2 mL加入到不同試驗組，在25 ℃、180 r/min搖床中培養。

1.2.3 酶活力測定

搖床培養15 d后，取出一定量的發酵液，經5 000 r/min離心20 min后，取上清液測試酶活力[13-14]，酶活力單位定義為1 min轉化1 μmol ABTS，使ABTS自由基濃度增加量。每個處理做3次重復取平均值作為酶活力。

1.2.4 單因素試驗研究

（1）葡萄糖添加量對漆酶酶活的影響。在基礎培養基中分別加入葡萄糖15、20、25、30 g和35 g，蛋白胨4 g，加入10 mL微量元素溶液，每個水平分別做3次重復，接種培養15 d后，測定酶活力，記錄結果（下同）。

（3）初始pH對漆酶酶活的影響。在基本培養基中添加20 g葡萄糖，C/N為5，添加10 mL微量元素溶液pH為分別調節到5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，培養后測定并記錄結果。

（4）微量元素添加量對漆酶酶活的影響 在基本培養基中添加20 g葡萄糖，C/N為5，溶液pH調節6.0，添加微量元素溶液量分別為5、10、15、20 mL和25 mL，培養后測定并記錄結果。

1.2.5 正交試驗研究

通過單因素優選的四個不同因素的三個水平，采用L9（34）正交實驗設計，進一步確定因素的主次及發酵產漆酶的最佳工藝。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖添加量對漆酶酶活的影響

在基礎培養基中分別按1.5%～3.5%的量添加葡萄糖，其他培養條件不變，研究葡萄糖的添加量對產漆酶的酶活的影響，發酵至15 d后取上清液進行測定酶活力，結果如圖1所示。

圖1 不同葡萄糖添加量對蜜環菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖1可見，葡萄糖添加量對發酵產漆酶的酶活力隨著葡萄糖的增加，漆酶的酶活先升高后緩慢下降的趨勢。當1 L培養基中添加2.5%葡萄糖時產漆酶量最多。繼續增加含糖量可能對蜜環菌的生長產生部分抑制作用，分泌的胞外漆酶量略微下降。可見，在培養時過高的葡萄糖濃度既不經濟，又不利于蜜環菌的生長。

2.2 不同碳氮比對漆酶酶活的影響

保持碳源氮源總量不變的前提下，以葡萄糖作為碳源，蛋白胨做氮源，設置5個不同水平的C/N，研究其對蜜環菌發酵產漆酶酶活的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同碳氮比對蜜環菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖2可見，在碳氮源總量不變的前提下，隨碳源增加，蜜環菌分泌的胞外漆酶酶活力呈現先增高后降低的趨勢，反映出同葡萄糖效應同樣的影響效果。當1 L培養基中添加22.5 g葡萄糖和7.5 g蛋白胨（即C/N=3）時產漆酶量最多。

2.3 不同初始pH對漆酶酶活的影響

調整配制完畢的培養基的pH在5～7共5個水平，分別測定發酵后的漆酶產量，結果如圖3所示。

圖3 不同初始pH對蜜環菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖3可見，發酵培養基初始pH維持在5～6時，蜜環菌生產的胞外漆酶活性較高。此范圍的pH跟基本培養基配制完后的pH接近，在生產漆酶時，可以考慮不用調整pH，保持自然的pH即可。pH繼續升高，漆酶產量明顯降低，主要是由于較高pH對蜜環菌的生長有一定地抑制作用。

2.4 不同微量元素添加量對漆酶活力的影響

通過只改變微量元素的添加量，分別加入5～25 mL微量元素溶液，其他培養條件一致的情況下，培養完成后測定酶活力如圖4所示。

圖4 不同微量元素溶液添加量對蜜環菌胞外漆酶酶活的影響圖

由圖4可見，添加適量微量元素對蜜環菌發酵生產漆酶有益，可以促進菌體的生長，進而增加發酵液中漆酶的酶活。當1 L培養基中添加10 mL微量元素溶液時，發酵完成后漆酶活力達到峰值。加入過多的微量元素，漆酶的產量明顯下降，可推斷其對蜜環菌的生長存在抑制作用。

2.5 正交實驗結果及分析

根據單因素的實驗結果，從4個因素中各自選取3個水平進行L9（34）正交實驗設計。因素水平表設計見表2，正交實驗的結果見表3。

表2 因素水平表

由表3可知，影響蜜環菌發酵生產漆酶的因素主次順序依次為葡萄糖添加量、C/N、微量元素添加量和初始pH。可見在培養基中的碳源對蜜環菌產漆酶影響較大，需要對添加碳源的種類進一步研究，確定最佳碳氮比以提高漆酶的生產效率。pH對產漆酶的影響相對較小，因而可以考慮配制基本培養基后，按照自然的pH進行發酵。

表3 正交實驗的結果表

2.6 驗證結果及分析

按照以上結果中最優方案，進行3次重復實驗，測得1 L發酵液中漆酶活力為51202.0U，相對標準偏差小于5%。高于正交表格中實驗數值，說明此工藝的優越性。

3 結論與討論

確定蜜環菌發酵培養生產漆酶的最佳方案為添加葡萄糖2.5%，碳源氮源比為3，基本培養基中附加15 mL/L微量元素，pH5.0為最有利于漆酶的積累。可作為工業生產漆酶的參考方案。在實際生產過程中，由于pH的影響較小，可以直接利用配制完成的培養基進行發酵生產，無需調整pH。

發酵生產胞外漆酶的最適培養時間出現在14 d左右，此時酶活力最高，本次研究統一在15 d采集樣品測定活力。比蜜環菌達到最大生長量的時間（10 d左右）有所滯后，說明當蜜環菌達到最大生長量后，胞外積累的漆酶數量才可達到峰值，從動力學角度分析，這種胞外漆酶的合成模型可能屬于滯后合成型，需要進一步的研究確定，此時是分離純化漆酶的最佳時間段。培養時間再長漆酶可能發生部分降解，影響產量。

參考文獻：

[1]楊海龍.藥用真菌深層發酵生產技術[M].北京：化學工業出版社，2009.

[2]劉 宇，龔思慧，彭 楠，等.蜜環菌液態發酵培養基及補料分批發酵工藝的優化[J].食品與發酵工業，2016，42（5）：187-191.

[3]范文霞，蔡友華，劉學銘，等.毛云芝菌產漆酶液體培養條件的優化[J].食品與生物技術學報，2008，27（3）：88-93.

[4]吳香波，謝益民，馮曉靜.白腐菌漆酶催化聚合造紙廢水中木素的研究[J].環境科學與技術，2010，33（1）：23-26.

[5]張學才，徐美紅，李 麗，等.王劍波白腐真菌漆酶處理幾種有毒環境污染物的研究[J].化學與生物工程，2006，23（9）：40-42.

[6]郭 梅，白東清，蒲 軍，等.雜色云芝漆酶用于提取人參總皂甙的研究[J].食品科學，2006，27（2）：166-168.

[7]劉家揚，焦國寶，有小娟，等.真菌漆酶的性質、生產及應用研究進展[J].生物技術通報，2016，32（4）：24-33.

[8]司 靜，崔寶凱，戴玉成.栓孔菌屬漆酶高產菌株的初步篩選及其產酶條件的優化[J].微生物學通報，2011，38（3）：405-416.

[9]徐雪霏，畢云楓，蔣海芹，等.黃多孔菌產漆酶最佳培養條件的優化[J].紡織學報，2012，33（2）：63-67.

[10]萬善霞，滑 靜，王文平，等.杏鮑菇漆酶部分酶學性質的研究[J].中國農學通報，2009，25（21）：107-109.

[11]Hakulinen N，Kiiskinen L L， Kruus K， et al. Crystal structure of alaccase from Melano copper site[J]. Nature Structural Biology，2002，9（8）：601-605.

[12]J Jordaan，WD Leukes. Isolation of a thermostable laccase with DMAB and MBTH oxidative coupling activity from a mesophilic white rot fungus[J]. Enzyme and Microbial Technology，2003，33（2）：212-219.

[13]吳 涓，李清彪，肖亞中，等.蜜環菌胞外漆酶酶活力的分光光度法測定[J].廈門大學學報（自然科學版），2001，40（4）：893-897.

[14]張 鵬.以ABTS為底物測定漆酶活力的方法[J].印染助劑，2007，24（1）：43-45.