兒茶素-稀土配合物的合成、表征及抗菌活性

余康，田翠翠，李霞，廖學品,2,3,＊，石碧,2,3

1四川大學生物質與皮革工程系，成都 610065

2四川大學，皮革化學與工程教育部重點實驗室，成都 610065

3四川大學，制革清潔技術國家工程實驗室，成都 610065

1 引言

食源性細菌以食品為主要渠道進行傳播和感染，是影響食品質量與公共安全的重要生物污染源。隨著抗生素為主的抗菌藥物的長期使用，食源性細菌的耐藥性問題已日趨嚴重。因此，開發多靶點、高效又安全的新型抗菌藥物替代抗生素變得越來越重要1。

兒茶素(Catechin，簡稱C)屬于黃烷醇類物質，廣泛存在茶葉、落葉松等植物體內，是具有多元酚結構的次級代謝產物，其B環上的鄰位酚羥基較高的加質子常數 lg KH表明其具有很好的反應活性，能以疏水鍵-氫鍵與蛋白質(酶)多點鍵合2,3，其分子中鄰位酚羥基可以與金屬離子形成穩定的五元螯合環4,5。此外，兒茶素還可以與多糖、脂質、生物堿及 DNA發生復合反應6–8。兒茶素可對多種微生物產生作用，Díaz-Gómez等9發現兒茶素對幽門螺桿菌的OD600影響甚大。Keller等10的研究表明 5 mg·m L?1的兒茶素可使腸道病原志賀氏菌數量減少 50%，同時，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(M IC)達到 0.625 mg·m L?1。由此可見，兒茶素可以與維持細胞生理活性的多種物質反應并對細菌表現出一定的抑制作用。但是，由于C穩定性差、膜穿透性不強11，在體內對細菌的抑制作用相對較弱。另一方面，稀土(Rare earth，簡稱 Re)作為一類具有特殊電子層結構的金屬元素，隨著稀土生物無機化學及其應用的發展，發現其具有抗凝血、抗炎殺菌、抗腫瘤等多種生物作用，并且可以與蛋白質(金屬酶)發生競爭性結合而影響蛋白質活性，也可以水解磷酸二酯鍵進而損傷遺傳物質DNA，還能夠改變磷脂表面電荷，影響與磷脂的結合牢固程度，同時，還可以與 Ca2+競爭磷脂上的結合位點引起細胞膜代謝功能的紊亂12–14。Wakabayashi等15的研究表明稀土對細菌、真菌、線蟲都有一定的殺菌作用，表現出廣譜抗菌性。Fujita等16發現在模擬廢水加入稀土Y或Eu (100 mg·m L?1)對硝化細菌的硝化作用具有顯著抑制。稀土離子Gd3+和Yb3+能明顯地抑制線粒體超氧化物歧化酶(SOD)的活性17。但是稀土離子的水溶性過強且易水解，與細胞的親和力較弱，難以到達細胞作用靶點，影響了其在抗菌領域的應用。因此，尋求合適的配體對于提高稀土的抗菌性能至關重要。

稀土離子屬于硬Lew is酸，離子半徑大、配位數高，易于和含氮、氧原子的硬堿配體配位，表現出強的親氧性18。而兒茶素是具有一定疏水性的多酚化合物，鄰位酚羥基可以與 Re3+發生配位反應，得到具有脂溶性的配合物 Re3+-C，從而使 C和 Re3+的抗菌活性優勢互補。由于該配合物解決了Re3+水溶性過強的問題及C的穩定性差、膜穿透性弱的問題，配合物Re3+-C將表現出更強的抗菌活性。另一方面，兒茶素及稀土本身對微生物具有一定的抑制作用，兒茶素能夠與蛋白、多肽及糖蛋白結合，兒茶素在作為抑菌劑的同時又可以作為載體將稀土有效的輸運到細胞中，從而增強稀土及兒茶素的抑菌作用。因此，本文以C為配體，合成了3種稀土配合物(La3+-C、Gd3+-C、Er3+-C)，并研究其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌及沙門氏菌4種食源性細菌的抗菌活性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜(IS10美國)、紫外可見分光光度計(UV-1800PC上海)、X射線光電子能譜(ESCA-850 日本)。

輕稀土：La(NO3)3·6H2O；中重稀土 Gd(NO3)3·6H2O；重稀土 Er(NO3)3·5H2O，均購于 A laddin(99%)。

兒茶素C(98%)購于上海瀚鴻化工科技有限公司。

大腸桿菌(Escherichia coli ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC23656)和綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC27853)購于中國工業微生物菌種保藏中心，沙門氏菌(Salmonella SIIA235)由四川大學制革生物技術研究室提供。液體培養基為營養肉湯培養基(Nutrient Broth，NB)，固體瓊脂平板和試管斜面培養基均在NB培養基中添加1.5%瓊脂。

2.2 實驗方法

2.2.1 配合物的合成

按照摩爾比4 : 1，分別準確稱取一定量的C和Re(NO3)3溶于適量的二次水中，將Re(NO3)3以滴加的方式緩慢加入到C溶液中，在室溫下混合攪拌反應6 h，冷凍干燥得到配合物Re3+-C。

2.2.2 菌懸液的制備

先將各試驗菌株于試管斜面培養基上活化培養 18 h，然后刮取數環生長良好的菌落于無菌生理鹽水中，并與 0.5麥氏比濁管(相當于菌懸液濃度 1.5 × 108CFU·m L?1，CFU，Colony-Form ing Units)對照，用無菌生理鹽水將各菌懸液濃度稀釋至 1 × 106CFU·m L?1。

2.2.3 抗菌活性的測定

抑菌圈：采用水平擴散法(牛津杯法)，將高溫滅菌的培養基趁熱加入無菌培養皿中，待其凝固制得無菌平板。吸取預先準備的菌懸液200 μL于無菌平板上，經無菌涂布棒涂布均勻，將無菌牛津杯輕置于含菌雙碟平板表面，接著取200 μL相應濃度的配合物溶液注入牛津杯內，然后于37 °C培養箱中培養24 h，測量各平板抑菌圈直徑(mm)。

最小抑菌濃度(M IC)：以二倍梯度稀釋法配制系列濃度的Re3+-C溶液，分別取1 m L加入無菌小試管中，利用營養肉湯培養基將菌懸液稀釋至1 × 106CFU·m L?1。同時將等量的含菌培養液加入到各無菌小試管中，于37 °C培養24 h。觀察其生長情況，以抑制細菌生長的最低配合物濃度(試管溶液澄清透明)為最小抑菌濃度19。

最小殺菌濃度(M BC)：取適量的最小抑菌濃度及其以上濃度的培養液于無菌瓊脂平板上，37 °C培養24 h。觀察其生長情況，以沒有細菌生長的瓊脂平板的最低配合物濃度為最小殺菌濃度。

采用統計學軟件(SPSS19.0) 實驗數據進行顯著性分析。

3 結果與討論

3.1 配合物的表征

兒茶素又稱兒茶精，是很多縮合類單寧的結構單體，為黃烷醇類的衍生物，分子式為C15H14O6。其分子結構中 B環上的鄰位酚羥基的lg KH比A環上兩個間位的酚羥基大，這表明B環具有較高的配位活性，從而使得其鄰苯二酚結構與金屬離子的絡合反應最容易發生。因此，稀土金屬離子Re3+與兒茶素B環鄰位酚羥基發生配位反應，形成具有五元螯合環的Re3+-C配合物20，反應原理如圖1a

3.1.1 傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析

采用KBr壓片法測得C和Re3+-C的紅外特征吸收光譜，如圖 2所示。配合物的紅外譜圖與配體 C相比發生了明顯的變化。3種配合物的特征吸收基本相似，表明 3種配合物在結構上具有相似性。兒茶素分子中 O―H鍵伸縮振動吸收峰出現在 3354 cm?1處，而當其與稀土離子(La3+、Gd3+、Er3+)形成配合物后吸收峰均向高波數移動。此外，1610–1530 cm?1苯環的骨架振動也明顯減弱20。同時，兒茶素在1346與1238 cm?1的吸收峰為 O―H鍵面內彎曲振動和 C―O鍵伸縮振動耦合所致，而配合物Re3+-C在這兩處的吸收峰明顯減弱或者消失，這均表明稀土金屬離子與酚羥基的氧配位成鍵21.22。

圖2 C及Re3+-C的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of C and Re3+-C.

3.1.2 紫外(UV)光譜分析

圖3為C及Re3+-C的紫外掃描圖譜。在C的紫外圖譜中，273 nm處出現一個明顯的吸收峰，是C分子結構中的酚羥基的特征表現。在與Re3+發生絡合反應后，使得配體C的電子云密度降低，整個分子中電子的離域程度增大，π電子的流動性增強，從基態躍遷到激發態所需的能量減小，因此該處特征吸收峰紅移至276 nm且吸光值有所減小23。

3.1.3 X射線光電子能譜分析(XPS)

C及Re3+-C的O 1s圖譜如圖4所示。C的O 1s圖譜僅有一個峰處于532.85 eV，這是C分子結構中C―OH的O所表現出來的。而在Re3+-C配合物中均出現兩個峰，峰1為酚羥基的C―OH，峰2則是因為螯合環的形成，酚羥基的O受到Re3+正電荷的影響，其電子云密度向 Re3+離子的空軌道偏移而降低，結合能(EB)位移至高能場24。

3.1.4 Re3+-C配合物配位數的測定

C與稀土離子 Re3+發生配位反應時，酚羥基的離解促進了H+的釋放，使反應體系的pH降低，可以根據反應后 pH的減少量來確定與 Re3+反應的配位數25。圖5所示為不同摩爾比的C與3種Re3+配位反應后pH的減少量。可以看出，對于同一種稀土而言，隨著摩爾比的增加，體系pH呈下降的趨勢，此時ΔpH隨之增大且在摩爾比為4 : 1時達到最大并趨于穩定。此外，比較相同摩爾比時不同稀土離子與C反應體系，隨著原子序數的增大，稀土 Re3+的半徑減小，配合物 Re3+-C中的Re―O鍵逐漸增強，而配體C的―OH上H受到中心離子(Re3+)的排斥作用更強，則其更容易離解釋而放出質子(H+)，使得反應體系pH降得更低26。因此，ΔpH隨Re3+原子序數的增大而增加，并且配合物的穩定性也隨之增加。

由稀土離子 Re3+的配位反應特性可知，其常見配位數為6–12，而C的分子結構中B環的鄰位酚羥基具有較高的反應活性，因此Re3+-C的配位數極有可能為8。其可能的結構如圖1b所示。

圖3 C及Re3+-C的紫外光譜Fig.3 UV spectra of C and Re3+-C.

圖4 C (a)及Re3+-C (b, c, d)的O 1s XPS圖譜Fig.4 O 1s XPS spectra of C (a) and Re3+-C (b, c, d).

3.2 配合物抗菌活性

表1為C、Re3+及Re3+-C對4種常見食源性細菌的抑菌圈直徑，數據統計分析表明在p ＜ 0.05水平Re3+-C配合物與Re3+相比差異顯著。可見，在一定范圍內，抑菌圈直徑與抑菌活性成正相關，因此，抑菌圈大小可以初步表征抑菌活性的強弱。由表中可以看出，四種細菌對C均不敏感，三種稀土離子 Re3+對四種測試菌株雖然都具有一定的抑制作用，但抑菌圈差異不大且抑菌效果并不顯著。相較Re3+及C而言，配合物Re3+-C的抑菌性能明顯提高，特別是對金黃色葡萄球菌表現出很強的抑菌性能，這可能是因為不同微生物細胞膜(壁)結構上的差異27，金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌，其細胞壁中肽聚糖含量為50%–80%，而綠膿桿菌、沙門氏菌及大腸桿菌這三種屬于革蘭氏陰性菌，肽聚糖含量僅為5%–20%。因此，對于不同的菌株，配合物Re3+-C表現出了一定的差異性。

圖5 C與Re不同摩爾比反應體系的pH變化量Fig.5 pH reduction of catechin and rare earth chelating

表1 抑菌活性(抑菌圈)的測定Tab le 1 Antibacterial activity(inhibition zone) of C, Re3+ and Re3+-C.

表2 C, Re3+ 及Re3+-C對四種食源性細菌的最小抑菌濃度Table 2 M IC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

表2為C、Re3+及Re3+-C對4種食源性細菌的M IC值。相較于C與Re3+單獨作用，3種配合物的M IC值均明顯降低，雖然表1中Re3+與Re3+-C的抑菌圈表現差異不大，相較Re3+及C而言，配合物 Re3+-C的抑菌性能明顯提高(統計學軟件SPSS19.0分析在p ＜ 0.05水平差異顯著)，這可能是因為抑菌圈大小作為初步評價抑菌活性指標存在一定的局限性。從M IC值可以看出配合物Re3+-C的抑菌活性可以看出，Re3+與 C的協同效應非常明顯。研究表明28,29，Re3+進入細胞內引起的生物效應主要與 Ca2+相關，而在生物體內，幾乎所有的生理活動都受到 Ca2+的調控，而三種稀土Re3+的離子半徑(1.061–0.881 nm)與 Ca2+的離子半徑(0.990 nm)都較為接近，而且Re3+對四種食源性細菌的抑菌活性隨著稀土原子序數的增大而增加，這是因為重稀土比輕稀土及中重稀土的生物毒性高30。因此，對于配合物Re3+-C，其首先利用C的脂溶性到達細胞膜31，從而減少了穿透細胞膜磷脂雙分子層的阻力，一方面使細胞與環境的能量和物質交換發生障礙，另一方面 Re3+進入細胞內可能干擾了 Ca2+的正常生物作用，引起細胞代謝紊亂，這可能是Re3+-C具有良好抑菌性能的原因。表 3是文獻報道的稀土配合物及其抗菌活性。可見，Re3+-C的抗菌活性較高，特別重要的是兒茶素來源廣泛且無毒，因此，Re3+-C具有廣闊的應用前景。

表4是C、Re3+及Re3+-C對4種食源性細菌的MBC，與Re3+及C相比，配合物Re3+-C的MBC值也顯著降低。結合表1、表2、表4可以發現，Re3+-C配合物的抑菌活性與Re3+和C相比均大大提高。一方面，這是因為Re3+-C的形成增加了Re3+的脂溶性，脂溶性影響配合物穿透細胞膜的能力，這對于Re3+抑菌活性的提高至關重要。另一方面，我們的前期研究表明22，配合物Re3+-C的穩定性隨稀土原子序數增大而增大，穩定性則影響配合物Re3+-C進入細胞中釋放Re3+的能力，因此，只有穩定性合適的 Re3+-C配合物才能更好地發揮 Re3+的作用。而Er3+-C的穩定性太強，Er3+難以在細胞中得到釋放，而相對較輕的稀土則更容易釋放并發揮作用。因此，配合物Re3+-C活性大小順序為Gd3+-C ＞ La3+-C ＞ Er3+-C。再者，因為稀土離子(Re3+)和鈣離子(Ca2+)的半徑相當，而研究表明稀土可以進入細胞取代Ca2+而影響微生物代謝，離子半徑越接近Ca2+，對細胞的影響就越大，因此配合物Re3+-C的半徑大小對抗菌性也有很大的影響。而Gd3+與Ca2+的離子半徑最為接近(分別為 0.938和 0.990 nm)，因此，Gd3+-C的抑菌活性相對較好。

表3 不同配體的稀土配合物的抗菌活性Tab le 3 Antibacterial activity of rare earth com p lexes of different ligands.

表4 C, Re3+及Re3+-C對四種食源性細菌的最小殺菌濃度Table 4 M BC of C, Re3+ and Re3+-C against four kinds of food-borne bacteria.

4 結論

水相中兒茶素 C可與稀土離子 Re3+形成配合物，配位數為8，配合物穩定性與Re3+的結構有關。由于兒茶素 C增加了 Re3+的脂溶性，使得 Re3+-C的抗菌活性較Re3+顯著提高，并表現出明顯的協同作用，同時，Re3+-C對四種食源性細菌的抗菌活性表現出一定的差異性，這與供試菌株的性質及配合物自身的結構(如中心離子半徑，配位數，穩定性等)有關。后續將對稀土離子在細胞中的分布以及Re3+-C的作用靶點展開研究，同時，Re3+-C納米抗菌劑同樣具有廣闊的研究前景。

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