不同基質對‘寒香蜜’葡萄插條生長及VvLFY和VvAP1基因表達的影響

李曉鵬，安顏穎，上官凌飛，房經貴*

（1. 南京農業大學園藝學院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095；2. 南京農業大學農學院，江蘇南京 210095；）

開花是植物生命過程中的重要環節，它標志著植物從營養生長到生殖生長的轉變，植物花發育機理也是植物發育生物學研究的熱點之一。植物花發育過程大致可分三個階段：開花決定（成花誘導）、花的發端和花器官的發育。開花決定階段中，莖端分生組織形態上沒有變化，但是在生理生化和基因表達層面發生了改變[1]，影響這一階段的因素主要是光照、溫度、水分和營養條件等；花的發端指莖端分生組織向花分生組織轉變，此過程由花分生組織決定基因控制[2]；花器官的發育過程中，花器官特征基因決定花器官的特征，即決定花器官原基發育為各花器官。當植物內外環境達到合適的條件時，開花基因就會啟動花分生組織特征基因，使植物從營養生長轉變到生殖生長。

目前，人們通過對擬南芥和金魚草等模式植物，進行了大量的關于成花過程相關基因的研究，對花發育分子機制網絡已有一定的認識[3-4]。LEAFY（LFY）基因在花發育中起關鍵作用[3,5]，是決定從營養生長向生殖生長階段轉變的重要元件[6-7]，還參與維持花分生組織的正常功能、成花啟動、防止花分生組織的逆轉等功能[8-10]。但是該基因在植物組織內的表達并不呈現專一性[11]。APETALA1（AP1）基因即是花分生組織特征基因，屬于MADS-box基因家族[12]，AP1基因是LFY基因的直接靶基因[13]，LFY基因靠激素調控路徑正向調控AP1基因的表達[14-15]，AP1基因在LFY基因的下游表達，又正向作用于LFY基因的表達。

葡萄是世界范圍內的重要果樹，葡萄花發育有很多獨有的特點[16]，研究其花器官的發育和果實的形成具有重要的理論和實踐意義。葡萄成花周期在一年以上，春季花序從芽側生分生組織（原基）發端，夏季進入休眠狀態，翌年結束休眠產生花與果實[17-18]。扦插育苗一直是葡萄苗木繁殖的主要方法，具有育苗時間短、繁殖量大、操作簡單、能保持品種優良性狀等優點[19]。扦插過程中，葡萄插條的生長狀況受到育苗基質的透水、透氣能力和肥力影響，從而影響著葡萄苗木的育苗周期和經濟效益。在前期的試驗中發現，部分葡萄插條會長出花序，并且不同扦插基質之間的插條對比尤為明顯。針對這一現象，本研究選用不同物理性質的基質，通過對不同基質條件下葡萄插條花發育關鍵基因（LFY和AP1）表達的研究和分析，找出扦插基質、成花關鍵基因和插條花序生長之間的關系，進而為葡萄花發育調控提供理論參考。

1 材料與方法

試驗于2015年在南京農業大學園藝學院葡萄實驗大棚中進行。

1.1 試驗材料

供試品種為歐美雜種‘寒香蜜’（Reliance）。在2015年12月，選取生長健壯且粗度較為一致的枝條，修剪為1 m的插條，層積放置到2016年3月14日，修剪成含兩個芽的插條用于試驗。插條下剪口靠節斜剪，上剪口距離芽眼3 cm平剪，用清水浸泡插條24 h左右，NAA800倍液處理15 s后插于營養缽中。扦插基質主要采用珍珠巖、蛭石和營養土以及3種基質的混合物，扦插基質具體配比如表1所示。每種基質處理設4次重復，每重復20株，每處理共80株。

1.2 試驗試劑

RNaseFree DNase酶Ⅰ、Ex-Taq酶、dNTPs、DNA Marker、SYBRGreenⅠ購自日本TakaRa公司；SuperScript Ⅱ反轉錄酶、RNaseOUTTM Ribonuclease Inhibitor購自Invitrogen公司。

1.3 熒光定量PCR引物設計

鑒于葡萄花發育相關基因的重要性，根據植物成花途徑中有關基因的上下游關系、相互作用方式以及功能特點，上調基因VvLFY和花器官特異性基因VvAP1作為研究對象[20]，選取UBI作為內參基因。引物序列（表2），由上海捷瑞生物技術有限公司合成。

1.4 RNA提取和cDNA合成

分別于2016年3月23日、3月29日、4月3日、4月9日4個時期采集插條嫩枝，液氮研磨成粉備用。葡萄RNA的提取采用CTAB法[21-22]，參照RNase Free DNase酶Ⅰ說明書進行DNA消化。以總RNA為模板，參照SuperScriptⅡ反轉錄試劑盒說明書進行操作。cDNA放于-20 ℃下保存備用。

1.5 熒光定量PCR

表1 各處理基質配比用量（體積比）Table 1 Matrix combinations and amounts of different treatments (V/V)

表2 引物用途及序列Table 2 Sequence information of primers

參照已有研究報道[23-25]，分別取2 μg葡萄芽不同發育時期的cDNA為模板和相應的引物。利用Rotor-Gene熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR，反應體系按SYBR GreenⅠ（TOYOBO, Osaka，Japan）說明書進行。優化后的反應條件為95 ℃預變性60 s；95 ℃預變性20 s；58 ℃預變性20 s；72 ℃預變性20 s；45個循環。利用溶解曲線分析引物的特異性擴增。每組3次重復。試驗得到的數據用LinReg PCR和Rotor-Gene軟件計算，利用相對定量分析法進行分析[26]。

2 結果與分析

2.1 不同基質插條生長狀況

2.1.1 苗木扦插成活率

由于空間原因，每個處理的插條首先集中扦插于大營養缽中，2016年4月15日插條基本成活，再分裝于小營養缽中。分裝過程中對不同扦插基質的插條根系及地上部的生長情況進行測量，結果見圖1和表3。由表3可知，6種基質中的插條成活率都在90%以上，基質A最低，成活率為91%，其它基質的成活率幾乎為100%。

2.1.2 苗木新根數量及長度

由表3可知，4月15日，基質A和基質B插條根部大部分處于白色的愈傷組織階段，基質B生有零星的新根。其它4種基質中，扦插條均長出大量的新根，新根數目由低到高的處理分別為基質D、基質C、基質E和基質F，平均數目分別為27.6條、31.4條、53.2條和70.3條。新生根系的長度與根數目呈正相關，根數目越多，新根越長。根平均長度最短的是基質B，為1.344 cm，最長的為基質F，為8.203 cm。

圖1 4月15日各個處理扦插苗生長情況Figure 1 Growth status of grape cuttings on April 15

2.1.3 苗木新生枝條生長情況

4月15日，各處理新生枝條的長度由低到高的順序為基質B、基質A、基質C、基質D、基質E和基質F，高度分別是1.7 cm、2.2 cm、3.6 cm、6.9 cm和7.7 cm，基質A和基質B、基質C和基質D的新生枝條和根系的生長量不成正比，基質A并沒有長出新根，這種情況同樣出現在基質C和基質D兩種處理中，基質D的新根數量少于基質C，但其地上部的生長狀況好于基質C。

到5月30日時，地上部的枝條生長情況與4月15日類似，基質A和基質B中的枝條長勢矮小，其它4種基質長勢健壯，新枝的高度和節間長度明顯大于前兩種基質的插條。

2.2 不同基質插條成花情況

表3 4月15日不同基質組合的葡萄插條根系生長情況Table 3 Effect of different substrate combinations on roots development of grape cuttings on April 15

隨著插條的生長，3月29日基質E和基質F開始出現花苞，但是花苞產生后持續了一個月左右，最終枯萎脫落。期間，花苞的大小并沒有太大的變化。基質C、基質D的插條地上部發育遠遠好于基質A和基質B的插條，但是這4個處理并沒有花苞出現。

2.3 不同基質成花基因的表達情況分析

根據葡萄插條的生長動態以及花苞抽生情況，選取了4個時期的插條為材料，進行成花基因的表達分析，基因分別為VvLFY和VvAP1。

VvLFY基因在不同基質的插條中的表達趨勢如圖2所示，不同處理的表達趨勢不同。VvLFY在4個時期的表達整體呈下降趨勢?；|E和F處理中，VvLFY在3月23日和3月29日的表達量明顯高于其它4種處理，4月3日，基質E和F處理的基因表達量快速下降，表達量降低到與其它4種處理一致的水平。但是基質C和基質D的插條VvLFY表達量變化雖然不是特別明顯，但是總體上的趨勢呈先上升，在3月29日到達高峰，隨后降低到一致水平。

圖2 不同時期VvLFY基因的表達水平變化趨勢Figure 2 The variation of expression levels of VvLFY at different periods

VvAP1基因在不同基質插條中的表達趨勢如圖3所示，VvAP1基因的表達呈先上升后下降的趨勢，但是有花苞形成的基質E和F的插條的VvAP1表達量在3月23日、3月29日和4月3日的表達量高于其他基質中的插條，6種處理在4月3日的表達量處于高峰，4月9日各基質的插條VvAP1基因表達量下降，基質E和F的插條VvAP1表達量在6種基質處理中處于中游水平，而前期基因相對表達量最低的基質A和B處理的基因表達量在4月9日表達最高。

3 討論

3.1 不同基質對葡萄扦插效果的影響

在扦插的過程中，選擇適宜的基質是決定扦插苗生產是否健康的重要因素。前人的研究表明，基質的種類、不同配比對插穗生根影響差異顯著[27]，不同基質的配比對基質的理化性質改變明顯[28]。適宜的基質與基質的含水量、孔隙度和pH密切相關，基質的含水量高，則降低基質的透氣性，插穗下端易腐爛；基質的含水量過低，雖然增加了基質的透氣性，但插穗可能因缺水導致枯萎現象?？紫抖鹊母叩蜎Q定了基質中氣相和液相的比例，從而影響插穗的成活率[29]。

圖3 不同時期VvAP1基因的表達水平變化趨勢Figure 3 The variation of expression levels of VvAP1 at different periods

本試驗的結果表明，在不同的基質中，插條的根系發育、地上部的生長均有明顯的差異。從生根情況看，所有含珍珠巖的基質插條的生長狀況良好，其中，基質E和基質F優于其他處理。插條的生根狀況會受到基質性質的影響?；旌匣|中珍珠巖的持水性較差，但透氣性較好，在經常澆水的前提下，有利于根系的形成，提高成活率和生根率；蛭石的吸水保水能力強，透氣性比珍珠巖略差，含有蛭石的處理插條生長情況比珍珠巖略差；泥炭土的透氣性最差，結果表明泥炭土對葡萄插條的生長不利。

3.2 不同基質對葡萄扦插成花的影響

在本研究的6個處理中，最終僅有兩種處理的插條產生了花苞，兩種插條的共同點是初期抽生出花苞，最終根系及新生枝條生長狀況最好。高等植物的營養生長和生殖生長互相影響，扦插苗脫離母體，花苞的生長得益于枝條內儲存的營養物質，基質E和F的插條所處的環境適宜，促進了花的分化，因此著生了花序，但在生長過程中由于營養生長的旺盛，給花序的營養供給不足，花序掉落，這也證明了扦插苗的營養生長占有主要的地位。

3.3 成花基因的表達對葡萄扦插成花的影響

LFY基因是花分生組織的特異性基因。開花誘導后，植物的LFY基因被激活，LFY在頂端花序分生組織的周邊積累，然后在花原基進行強表達，接著在花發育過程中繼續表達[5]。LFY基因對分生組織的營養性生長起抑制作用，使更多的分生組織細胞轉向花原基的形成[13,30]。本試驗中，各個處理的VvLFY基因均有一定量的表達，這表明葡萄插條全部具有成花的潛力。基質E和基質F的VvLFY基因表達量較高，促進了花序的形成，而其它處理的VvLFY基因表達量較低，對抽生花序的影響較低，最終由于插條的生長狀況不良導致不能形成花苞。

在高等植物的成花過程中，AP1基因是花器官發育的相關基因，是一個關鍵的調控點，AP1基因的表達受LFY基因的調控。本研究發現VvAP1基因的表達量變化滯后于VvLFY的表達量，說明了VvLFY正向調節VvAP1的表達，但4月3日VvAP1仍然有一個表達高峰，此時的VvLFY的表達量已經降低，這表明VvAP1基因的表達受多種因素的調節，不僅僅限于VvLFY基因。VvAP1基因在插條的生長過程中呈先升高后降低的趨勢，表明所有插條的花發育進程在萌芽期沒有中斷，只是由于環境因素并沒有產生花序，下一步的研究將對此時期的芽結構進行觀察分析。

4 結論

成花是高等植物最關鍵的生命過程，決定繁育的成敗，由內在控制元件和外部環境共同控制[31-32]。本研究通過不同配比的基質扦插葡萄枝條，發現透氣性更好的基質珍珠巖、蛭石中有利于插條的生長，也就是珍珠巖和蛭石混合基質或者珍珠巖基質中的插條表現更好，甚至能生長出花序，其他4種基質的插條新枝發育不良，不能生長出花序。成花關鍵基因LFY和AP1在插條嫩枝的表達說明外部環境能影響插條成花的潛力；雖然后兩種基質處理的插條新枝生長良好，能促進花序形成，但由于營養物質過多消耗在根和新枝等營養器官，導致花序發育不良、脫落，說明生殖生長建立在營養生長的基礎之上[33]。

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