河南漢族人群精神分裂癥患者線粒體ATP6基因9115、9185位點突變分析

何書平，仝冬曉，司沛茹，王麗雯，程美錦，景嘉楠，程曉麗

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學遺傳與細胞生物學系 鄭州 450001 2)鄭州市精神病防治醫(yī)院精神科 鄭州 450005 3)鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院婦產(chǎn)醫(yī)學部實驗室 河南洛陽 471000 4)鄭州大學第三附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450052 5)鄭州大學第三附屬醫(yī)院河南省新生兒疾病篩查中心 鄭州 450052 6)河南省胸科醫(yī)院檢驗科 鄭州 450008

精神分裂癥是以基本個性，思維、情感、行為的分裂，以及精神活動與周圍環(huán)境不協(xié)調(diào)為主要特征的一類最常見的精神病，是目前最嚴重的一種重型精神病。精神分裂癥是一種多基因遺傳的復雜性疾病，其病因和發(fā)病機制一直是精神病學界研究熱點。生命體中大腦是耗能最高的組織器官，大腦能量需求改變是引發(fā)精神類疾病的重要原因之一[1]。一些研究[2-3]表明，精神分裂癥患者中的線粒體形態(tài)學、大腦能量代謝和呼吸鏈中酶活性等有一定程度的變化，在尸檢的大腦組織中，精神分裂癥患者紋狀體中線粒體結(jié)構(gòu)的完整性與對照組沒有差別，但是，尾狀核和殼核卻只有較少的線粒體，提示這些結(jié)構(gòu)的能量需求減少或者產(chǎn)生能量的能力降低。另外，和對照組相比，精神分裂癥患者尾狀核和前額葉皮層的少突膠質(zhì)細胞的線粒體體積、密度有明顯的降低，多巴胺神經(jīng)元的突觸前終扣出現(xiàn)線粒體的增生[4]。故線粒體功能障礙可能成為精神分裂癥發(fā)生的一個重要原因。ATP6基因位于線粒體基因上，其編碼的亞基6是組成復合物V的一個重要原件，該亞基參與了質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運通道的組裝，而線粒體內(nèi)膜的跨膜質(zhì)子電動勢是能量代謝的驅(qū)動力和調(diào)節(jié)劑。因此，該亞基若發(fā)生改變，則很有可能影響能量代謝[5-6]。本研究選取ATP6基因上的9115位點和9185位點進行分析，以觀察其對河南漢族人群精神分裂癥發(fā)生的影響。

1 對象與方法

1.1研究對象病例組共244例，其中男129例，女115例，平均年齡(39.5 ± 4.3)歲，均來自于鄭州市精神病防治醫(yī)院，均根據(jù)文獻[7]標準確診為精神分裂癥，排除診斷不明的個體，或伴有嚴重軀體疾病和腦器質(zhì)性障礙個體，或精神發(fā)育遲滯及癡呆患者。對照組選取同期健康體檢的無關隨機個體260人，其中男143人，女117人，平均年齡(40.3 ± 4.1)歲，與病例組無血緣關系，且家族中無精神病史或自殺者。2組性別構(gòu)成(χ2=0.719，P=0.397)和年齡(t=1.435，P=0.152)比較，差異均無統(tǒng)計學意義，具有可比性。本研究所有個體間均無親緣關系，均為河南漢族人，所有患者或其監(jiān)護人以及正常對照均知情同意。

1.2基因組DNA提取抽取受試者的外周靜脈血，經(jīng)EDTA抗凝，通過標準酚-氯仿法抽提基因組DNA。提取的DNA溶于滅菌的雙蒸水中，-20 ℃保存，以備使用。所提DNA樣本經(jīng)微量測定儀測定純度及濃度達標。

1.3引物合成、PCR反應條件、限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳及DNA測序分析兩個位點PCR擴增所需引物、退火溫度以及產(chǎn)物大小等見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。兩個位點分別使用的限制性內(nèi)切酶以及酶切片段長度見表2。酶切反應體系為20 μL，包括10×Buffer 2 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，ddH2O 7 μL；37 ℃恒溫水浴2 h[8]。限制性內(nèi)切酶均購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物分別用30 g/L瓊脂糖凝膠在110 V電壓下電泳40～50 min；紫外凝膠成像系統(tǒng)分析記錄電泳結(jié)果，并拍照留底。選取兩個位點的突變及野生型PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1 兩個位點引物序列及PCR反應條件

表2 兩個位點所用內(nèi)切酶及酶切片段

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。病例組和對照組的年齡比較采用兩獨立樣本的t檢驗，兩組間性別構(gòu)成和基因突變分析均采用χ2檢驗，并計算OR值及95%CI。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1線粒體ATP6基因9115位點檢測結(jié)果病例組中有9例9115A/G突變，對照組中有2例9115A/G突變(χ2=5.025，P=0.025，OR=4.790，95%CI=1.046～21.972)，電泳結(jié)果見圖1，測序結(jié)果見圖2。

2.2線粒體ATP6基因9185位點檢測結(jié)果對244例患者及260例對照樣本DNA進行酶切，電泳分析后未見突變(圖3)。

1:9115G(201 bp);2～7:9115A(176 bp+25 bp);M:Marker圖1 線粒體ATP6基因9115位點EcoRⅠ酶內(nèi)切PCR產(chǎn)物電泳圖

A：ATP6基因9115A;B：ATP6基因9115G圖2 線粒體ATP6基因9115位點突變測序圖

1～3:9185T(107 bp+24 bp);4:PCR產(chǎn)物(131 bp);M:Marker圖3 線粒體ATP6基因9185位點Apa Ⅰ酶內(nèi)切PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

復合物V是線粒體呼吸鏈的最后一個復合物，即ATP合酶，是一個多亞基復合物，由突出于膜外的可溶性F1和嵌于膜內(nèi)的F0組成，因此又稱F1F0-ATP酶。復合物V在線粒體中通過電化學梯度傳遞質(zhì)子，以ADP、Pi及Mg2+為原料合成ATP，為細胞供能。復合物V缺陷主要導致線粒體能量代謝障礙，主要損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]。線粒體基因ATP6編碼的亞基6是組成復合物V的質(zhì)子跨膜轉(zhuǎn)運通道的一個重要原件，位于F0集團，對質(zhì)子跨膜運輸為細胞供能起到了重要的作用，目前已知的所有母系遺傳的原發(fā)性ATP合酶缺陷均與亞基6有關[8]。有學者[10]對93例日本精神分裂癥患者以及對照組進行全線粒體基因測序，分析發(fā)現(xiàn)線粒體ATP6基因非同義突變僅僅在精神分裂癥患者中出現(xiàn)。另外有研究[11]表明，線粒體ATP6基因突變與家族性雙側(cè)腦紋狀體壞死有關。

線粒體ATP6基因位于線粒體基因組nt8527～9207，本研究對線粒體ATP6基因的兩個位點9115和9185進行分析，發(fā)現(xiàn)病例組和對照組9115位點突變率比較差異有統(tǒng)計學意義，9115位點A→G突變可能增加精神分裂癥的發(fā)病風險，文獻[10]的研究也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)果。LIU等[12]認為線粒體ATP6基因的9115位點的非同義突變可能通過影響線粒體功能而引起雙向情感障礙和抑郁癥的發(fā)生。本研究未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組中出現(xiàn)9185位點突變。但是9185位點多態(tài)性變化引起位于ATP6亞基肽鏈C末端附近220的氨基酸在脯氨酸和亮氨酸之間變化，有研究[13]表明9185位點T→C的錯義突變引起線粒體功能失調(diào)和周圍神經(jīng)病變，進而引起加拿大一個家族出現(xiàn)了家族性Leigh綜合征。故該位點是一個功能性位點，對該位點仍需進行深入的研究。

精神分裂癥發(fā)病機制的研究[14-15]中較為多見的是單胺類遞質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)再生障礙等學說。以線粒體基因突變?yōu)榫穹至寻Y病因?qū)W的研究近年來雖然越來越多地受到關注，但研究[16]多集中于線粒體rRNA基因變異、線粒體tRNA基因變異。其他研究的欠缺使線粒體DNA變異與精神分裂癥的關系紛爭不斷，線粒體在精神分裂癥中的作用尚未完全闡明，各種研究都亟待豐富。

[1] 劉兆云,陳剛.線粒體功能異常與精神分裂癥研究進展[J].精神醫(yī)學雜志,2013,26(4):311

[2] BANDELT HJ,OLIVIERI A,BRAVI C,et al. Distorted mitochondrial DNA sequences in schizophrenic patients[J].Eur J Hum Genet,2007,15(4):400

[3] ICHIKAWA T,ARAI M,MIYASHITA M,et al.Schizophrenia: maternal inheritance and heteroplasmy of mtDNA mutations[J].Mol Genet Metab,2012,105(1):103

[4] ANGLIN RE,MAZUREK MF,TARNOPOLSKY MA,et al.The mitochondrial genome and psychiatric illness[J].Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet,2012,159B(7):749

[5] MARAZZITI D,BARONI S,PICCHETTI M,et al.Psychiatric disorders and mitochondrial dysfunctions[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2012,16(2):270

[6] 田園如畫,周中和,陳會生.腺苷酸活化蛋白激酶在缺血預處理誘導的神經(jīng)保護中的作用[J].解放軍醫(yī)學雜志,2015,40(5):366

[7] 美國精神醫(yī)學學會.張道龍，譯.美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊[M].5版.北京:北京大學出版社,2014.

[8] 孫逸杰,景戈翰,楊菁,等.TFAM基因rs10826178與rs4390300兩多態(tài)位點與精神分裂癥的關系[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2015,50(6):773

[9] 李溪遠.線粒體呼吸鏈酶復合物V缺陷與線粒體病[J].中國當代兒科雜志,2013,15(7):596

[10]CHINNERY PF,HOWELL N,ANDREWS RM,et al.Clinical mitochondrial genetics[J].J Med Genet,1999,36(6):425

[11]UENO H,NISHIGAKI Y,KONG QP,et al.Analysis of mitochondrial DNA variants in Japanese patients with schizophrenia[J].Mitochondrion,2009,9(6):385

[12]LIU VW,YANG HJ,WANG Y,et al.High frequency of mitochondrial genome instability in human endometrial carcinomas[J].Br J Cancer,2003,89(4):697

[13]MUNAKATA K,FUJII K,NANKO S,et al.Sequence and functional analyses of mtDNA in a maternally inherited family with bipolar disorder and depression[J].Mutat Res,2007,617(1/2):119

[14]王麗雯,何書平,張景亮,等.ESR1基因單核苷酸多態(tài)性及單倍型與精神分裂癥的關聯(lián)研究[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2013,30(1):21

[15]劉書蓮,程曉麗,溫雯靜,等.多巴胺D2、D3受體基因多態(tài)性與漢族人精神分裂癥相關研究[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2012,38(3):155

[16]BI R,TANG JS,ZHANG W,et al.Mitochondrial genome variations and functional characterization in Han Chinese families with schizophrenia[J].Schizophr Res,2016,171(1/3):200