黃芪及其復配組合調(diào)節(jié)正常小鼠免疫功能的探索△

王晨，于冰莉，崔潔，侯俊玲*，王文全，*，張莉

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193)

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功能，常用于治療脾肺氣虛諸癥，有“補氣之長”的美稱[1]。中醫(yī)藥學中“免疫”一詞，最早出現(xiàn)于18世紀《免疫類方》一書，意為免除“疫病”的危害[2]。中醫(yī)認為疾病的發(fā)生是由于人體正氣與致病因素的正邪斗爭中正不敵邪而引起的，進而導致陰陽失調(diào)，氣血逆亂[3]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》提出了“正氣存內(nèi)，邪不可干。邪之所湊，其氣必虛”的理論。即正氣充足則邪氣無法侵襲人體，邪氣一旦侵入人體則表明正氣已經(jīng)虛衰。由此可見，正氣起到了護衛(wèi)人體免受邪氣侵害的功能，這與西醫(yī)學中機體的免疫功能學說類似[4]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論從扶正祛邪這一基本治則出發(fā)[2]，通過補中益氣、補氣固表、充盈衛(wèi)氣以達到調(diào)節(jié)人體免疫力的功效。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖最為重要且效果確切的藥理活性莫過于免疫調(diào)節(jié)作用。傳統(tǒng)中藥尤其是補益類中藥主要通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能而發(fā)揮其獨特的治療作用，且這類藥物的活性部位主要是多糖[5]。本文以傳統(tǒng)中醫(yī)理論為基礎，借助現(xiàn)代藥理研究手段，通過探討黃芪及其與各藥味復配組合對正常小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、血清溶血素含量、腹腔巨噬細胞吞噬率的影響，根據(jù)保健食品評價相關指標，從而篩選出最佳復配組合，為以黃芪為原料的相關健康功能產(chǎn)品開發(fā)提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設備

RE-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；BP211D型電子分析天平(德國Sartorius公司)；寶特Bio-TekELX800光吸收酶標儀(濟南鑫貝西生物技術有限公司)；OLYMPUSCX23生物顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)；BKQP-75L立式高壓滅菌鍋(濟南博鑫生物技術有限公司)。

1.2 試劑與材料

SA緩沖液(上海源葉生物有限公司)；2%壓積羊血細胞(SRBC)、10%SRBC和1%雞紅細胞(鄭州九龍生物制品有限公司)；文齊試劑(天津市現(xiàn)代高科技研究院中山研究所)；溴甲酚紫(天津市巴斯夫化工有限公司)；Giemsa染液、Hanks液和補體(豚鼠血清)(北京耀威振興科技有限公司)；無支原體小牛血清(浙江天航生物科技有限公司)；香菇多糖膠囊(湖北創(chuàng)力藥業(yè)有限公司，批號：20160502)。

黃芪、女貞子、大棗、陳皮、甘草、覆盆子、黃精購自河北美威藥業(yè)股份有限公司。酒蓯蓉購自內(nèi)蒙古王爺?shù)厣镏破饭煞萦邢薰尽８髦兴帢悠酚芍袊t(yī)學科學院藥用植物研究所王文全教授鑒定，分別為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根、木犀科植物女貞子LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實、鼠李科植物棗ZiziphusjujubeMill的干燥成熟果實、蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco.的干燥成熟果皮、豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖、薔薇科植物華東覆盆子RubuschingiiHu.的干燥果實、列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，百合科植物黃精PolygonatumsibiricumRed.的干燥根莖，樣品保存于北京中醫(yī)藥大學中藥資源系標本室。

1.3 動物

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)中有關調(diào)節(jié)免疫的功能產(chǎn)品中對小鼠種類及模型的要求[6]，選擇正常BALB/c小鼠為本研究實驗動物及模型。

BALB/c小鼠，雄性，18～22 g，70只，由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所動物實驗中心提供，許可證編號：SYXK(京)2013-0023。

2 方法

2.1 藥味配伍設計

以《太平惠民和劑局方》中經(jīng)典補虛方黃芪六一湯為基礎[7]，在臨床醫(yī)生的建議下，增加酒蓯蓉、大棗組成黃芪-甘草A組方，增加酒蓯蓉、陳皮組成黃芪-甘草B組方。以貞芪扶正顆粒為基礎[8]，在臨床醫(yī)生的指導下，增加黃精構成黃芪-女貞子A組方，增加陳皮、覆盆子構成黃芪-女貞子B組方。另設立黃芪多糖組，進行綜合分析比較。

2.2 黃芪多糖提取

將黃芪磨粉，過40目篩，水提醇沉(70 ℃提取2 h，提取2次，離心合并上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，4倍體積無水乙醇沉淀)，離心取沉淀。然后用蒸餾水復溶，過大孔樹脂脫色脫蛋白，收集流分后再次濃縮，冷凍干燥，得白色粉末，得率為0.12 g·g-1，4 ℃貯存，備用。

2.3 供試藥液配置

各組方采用傳統(tǒng)湯藥提取工藝進行提取(提取0.5 h、提取2次、料液比1∶10)，烘干，制得干浸膏粉，其各組方干浸膏得率為：黃芪-甘草A組，0.56 g·g-1；黃芪-甘草B組，0.50 g·g-1；黃芪-女貞子A組，0.19 g·g-1；黃芪-女貞子B組，0.25 g·g-1。采用蒸餾水溶解，按人(60 kg體質(zhì)量)每日用量的10倍量配置供試液，4 ℃保存。

2.4 陽性藥液配置

稱量適量香菇多糖膠囊內(nèi)容物，蒸餾水溶解，配置為31.00 mg·mL-1陽性藥液，4 ℃保存。

2.5 小鼠分組與給藥方式

BALB/c小鼠，雄性，18～22 g，70只。適應性喂養(yǎng)3 d后隨機分成7組，每組10只，分別為正常空白組、陽性藥組、黃芪-甘草A組、黃芪-甘草B組、黃芪-女貞子A組、黃芪-女貞子B組、黃芪多糖組。陽性藥組、供試液組每天以灌胃方式分別給予陽性藥液、供試藥液1次，正常空白組給予相同容量的蒸餾水1次，連續(xù)灌胃30 d。各組均正常飲食飲水。各供試液組給藥量為以生藥量為依據(jù)的各組方人體(60 kg體質(zhì)量)推薦量的10倍，具體給藥劑量見表1。

2.6 免疫功能檢測方法

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)中對免疫調(diào)節(jié)功能產(chǎn)品檢測指標的指導及建議，選定體質(zhì)量、臟器指數(shù)、血清溶血素測定及小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅血細胞實驗為本研究的相關測定指標。

2.6.1 體質(zhì)量、臟器指數(shù)的測定 灌胃，禁食12 h后，測小鼠體質(zhì)量，小鼠脫頸處死，摘取脾臟及胸腺稱質(zhì)量，按公式(1)計算臟器指數(shù)。

(1)

2.6.2 血清溶血素測定(HC50值) 參考佟長青等的方法[9]，在灌胃第26天時，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積羊血紅細胞進行致敏。第30天灌胃后禁食12 h，摘小鼠眼球取血，2000 r·min-1離心分離血清，備用。取96孔板，設樣品孔和空白對照孔，空白對照孔每孔加入100 μL稀釋的SA緩沖液；樣品孔每孔加入稀釋后的血清100 μL(血清稀釋方法：血清10 μL，用1 mL稀釋后的SA緩沖液進行稀釋)；再依次加入10%(V/V)SRBC 50 μL，補體100 μL(用SA溶液稀釋)，置37 ℃恒溫水浴中保溫30 min，以1500 r·min-1離心10 min。然后分別從空白孔和樣品孔中各取上清液50 μL，加入新的96孔培養(yǎng)板中，加文齊試劑150 μL。同時在96孔培養(yǎng)板內(nèi)設置半數(shù)溶血孔，往半數(shù)溶血孔加入10%(V/V)壓積羊血紅細胞12.5 μL，再加文齊試劑至200 μL。振蕩，混勻，放置10 min后用全自動酶標儀在540 nm處測定各孔光密度值(A)，按公式(2)計算HC50值。

(2)

2.6.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅血細胞實驗 本方法參考《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》[6]，在灌胃第26天時，每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積羊血紅細胞進行致敏。第30天灌胃后禁食12 h，乙醚麻醉，脫頸處死后腹腔注射加小牛血清的Hank′s液，4 mL/只。吸取腹腔洗液，0.5 mL腹腔洗液與0.5 mL 1%雞血紅細胞懸液置于試管中進行充分混勻。用注射器吸取0.5 mL混合液，滴到載玻片上，37 ℃孵育15 min。孵育結束后，拿出載玻片迅速用0.9%氯化鈉溶液將未貼壁細胞沖掉。然后用甲醇液固定，固定玻片1 min左右，將玻片用Giemsa液進行染色，約15 min。用蒸餾水輕輕沖洗載玻片，之后將載玻片放置于平臺上自然晾干，在顯微鏡40倍物鏡下計數(shù)，按公式(3)計算吞噬率。吞噬率為每100個巨噬細胞中，吞噬雞紅細胞的巨噬細胞所占的百分率。

(3)

2.7 數(shù)據(jù)處理

3 結果

3.1 小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的測定

各組小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變化見表1。

體質(zhì)量可以直觀反映動物整體健康狀況的好壞。在小鼠實驗周期結束時，測量其體質(zhì)量后發(fā)現(xiàn)，與正常空白組體質(zhì)量相比，黃芪多糖組的小鼠體質(zhì)量顯著高于空白組(P<0.05)，黃芪-女貞子B組的小鼠體質(zhì)量顯著低于正常空白組(P<0.05)，其余各組與正常空白相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

在實驗周期結束后，分別取小鼠脾臟、胸腺，稱質(zhì)量，計算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)。從中發(fā)現(xiàn)，與正常空白組脾臟指數(shù)相比，黃芪-甘草A組的脾臟指數(shù)顯著高于空白組(P<0.05)，而其余各組與空白相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

與正常空白組胸腺指數(shù)相比，黃芪-甘草A組、黃芪-甘草B組、黃芪-女貞子A組及黃芪-女貞子B組的胸腺指數(shù)顯著高于空白組(P<0.05)，其余各組與空白相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.2 小鼠血清溶血素的測定(HC50值)

各組小鼠HC50值變化見表2。

由B淋巴細胞分化產(chǎn)生的抗體參與機體的體液免疫，在綿羊紅細胞抗原的刺激下，小鼠B淋巴細胞產(chǎn)生溶血素，其水平的高低反映機體的體液免疫能力強弱，且溶血素的含量與機體體液免疫能力呈正相關[10]。根據(jù)表2可知，與正常空白組相比較，陽性藥組和黃芪-甘草B組均能顯著增加小鼠的HC50值(P<0.05)，其余各給藥組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

3.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅血細胞的測定

各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅血細胞吞噬百分率變化見表2，形態(tài)圖見圖1。其中小鼠巨噬細胞無明顯邊界膜、細胞顏色均一、無明顯深顏色顆粒，吞噬雞血后有明顯細胞邊界、有明顯深色顆粒。

根據(jù)表2可知，與正常空白組相比較，陽性藥組、黃芪-甘草A組、黃芪-甘草B組、黃芪-女貞子B組及黃芪多糖組的吞噬百分率均顯著升高，黃芪-女貞子A組無統(tǒng)計學差異。吞噬百分率由高到低順序依次為黃芪-甘草B組>黃芪-女貞子B組>黃芪多糖組>陽性藥組>黃芪-甘草A組>黃芪-女貞子A組>空白組。黃芪-甘草組間比較，可以發(fā)現(xiàn)黃芪-甘草B組顯著高于黃芪-甘草A組，說明黃芪-甘草與酒蓯蓉、陳皮配伍在小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力上好于黃芪-甘草與酒蓯蓉、大棗配伍。在黃芪-女貞子組間，發(fā)現(xiàn)黃芪-女貞子B組明顯好于黃芪-女貞子A組，表明黃芪-女貞子與陳皮、覆盆子配伍較優(yōu)于與黃精配伍。綜上所述，黃芪-甘草與肉蓯蓉、陳皮配伍的效果最佳。

表1 各實驗組小鼠體質(zhì)量與臟器指數(shù)變化情況

注：與正常空白組相比，*P<0.05。

表2 各實驗組小鼠HC50值與吞噬百分率變化情況

注：與正常空白組相比，*P<0.05；黃芪-甘草組間相比，▲P<0.05；黃芪-女貞子組間相比，△P<0.05。

注：圖中實線箭頭指示巨噬細胞，虛線箭頭指示被吞噬的雞紅細胞。圖1 各實驗組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅血細胞的計數(shù)

4 討論與結論

免疫功能是機體防御和清除各種有害因素的能力，即體內(nèi)“正氣”的主要體現(xiàn)。現(xiàn)代醫(yī)學對機體的免疫功能進行評價主要通過觀察對機體非特異性免疫功能(巨噬細胞吞噬活性)和特異性免疫功能的影響，其中特異性免疫功能又包括細胞免疫和體液免疫(血清溶血素含量)[11]。本文通過研究黃芪及其復配組合對正常小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、血清溶血素含量及腹腔巨噬細胞吞噬率的影響，篩選出了具有調(diào)節(jié)機體免疫功能的較優(yōu)復配組合。

在臨床上，調(diào)節(jié)免疫功能的物質(zhì)多為蛋白類藥物，如干擾素等。植物類藥物則多為單純多糖，如香菇多糖等。兩種類型藥物生產(chǎn)工藝較復雜，成本較高，且均為處方藥物，且有些藥物還具有一定的不良反應，不適合平時保健使用。本研究中所選藥味多為藥食兩用或可用于保健食品的中藥。因此，可制作為袋泡茶、固體飲料等，用作日常保健使用。同時，本研究設香菇多糖為陽性藥，并與黃芪多糖比較，試尋找出與陽性藥及黃芪多糖相當或優(yōu)于二者的組方復配，用以相關健康產(chǎn)品開發(fā)。

本研究結果表明，在臨床推薦劑量下，黃芪及其復配組合可不同程度上調(diào)節(jié)小鼠的免疫能力。其中，單一黃芪多糖可顯著增加小鼠體質(zhì)量、脾臟指數(shù)及腹腔巨噬細胞吞噬率；黃芪與甘草、酒蓯蓉、陳皮復配后在胸腺指數(shù)、血清溶血素含量及腹腔巨噬細胞吞噬百分率上有顯著增加；黃芪與甘草、酒蓯蓉、大棗配伍可顯著增加小鼠臟器指數(shù)和腹腔巨噬細胞吞噬百分率；黃芪與女貞子、黃精配伍可顯著增加小鼠胸腺指數(shù)；而黃芪與女貞子、陳皮、覆盆子復配可顯著增加小鼠胸腺指數(shù)和腹腔巨噬細胞吞噬百分率。根據(jù)各給藥組對各指標的影響強弱及有無顯著改變，綜合分析發(fā)現(xiàn)，在臨床推薦劑量下，黃芪及其相關復配組合調(diào)節(jié)小鼠免疫功能的藥效大小依次為：黃芪-甘草B組>黃芪多糖組>黃芪-女貞子A組>黃芪-甘草A組>黃芪-女貞子B組。

上述結果表明，單一黃芪多糖具有一定程度的調(diào)節(jié)免疫作用；黃芪-甘草組、黃芪-女貞子組也均可一定程度上調(diào)節(jié)免疫功能，但黃芪-甘草組調(diào)節(jié)免疫功能的作用強于黃芪-女貞子組。同時，黃芪-甘草與酒蓯蓉、陳皮配伍后，其調(diào)節(jié)免疫的功效強于黃芪多糖組、黃芪-女貞子組及黃芪-甘草A組，且相關指標多數(shù)優(yōu)于或與陽性藥組持平。黃芪-甘草與酒蓯蓉、陳皮配伍后，在黃芪與酒蓯蓉補益的基礎上，加之陳皮理氣健脾的功效，使之補而不膩，整體上調(diào)節(jié)身體機能，可能是本方效果優(yōu)于單一黃芪多糖及其他復配組合的主要原因。但本實驗設定劑量的依據(jù)為臨床醫(yī)生根據(jù)調(diào)節(jié)人免疫功能而推薦的處方，經(jīng)換算得到小鼠的灌胃劑量，目的是初步探索推薦劑量下的不同配伍組方，在動物體內(nèi)是否能夠呈現(xiàn)出藥效作用，即定性研究；本研究尚未進行組方間的量效關系考察，這也將是后續(xù)實驗研究的重點。

由此而見，黃芪-甘草與酒蓯蓉、陳皮配伍更具有開發(fā)為相關健康功能產(chǎn)品的巨大潛力。因此，本研究后續(xù)將對該組合進行更加深入的藥理活性實驗檢測及免疫機理研究，以期為相關健康產(chǎn)品研發(fā)提供更加切實有力、作用機理清楚的理論參考。

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