金黃地鼠血液中5種陰離子含量測定方法的建立△

王東輝，李先恩

(1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

血液中含有各種營養成分，如無機鹽、氧以及細胞代謝產物、激素、酶和抗體等，有營養組織、調節器官活動和防御有害物質的作用。雖然無機鹽在細胞、人體中的含量很低，但是作用非常大。研究表明[1]，維持鉀離子通道的生存電壓依賴于細胞內陰離子環境的性質。無機陰離子與維持體內酸堿度有關，同時無機陰離子是體內各種生化反應的代謝產物，與健康息息相關。乳酸是糖在無氧條件下進行酵解的產物，在血液中以乳酸根形式存在，參與到體內能量物質循環[2]；甲酸是體內某些氨基酸代謝過程中產生的；溴離子是形成基底膜所必需的元素，在動物體內有著不可或缺的生理作用；磷是機體內骨礦物質、膜磷脂、核苷酸以及核酸的主要成分之一，參與到機體礦物質代謝、骨骼發育、能量儲存、信號傳導以及蛋白質功能調節等多種細胞活動過程中[3]；硫是構成氨基酸的重要組成部分，它是構成細胞蛋白、組織液和各種輔酶的重要常量元素[4-5]。

血液樣品中陰離子的含量測定方法多集中在乳酸根的含量測定，林紅賽等[6]建立了離子色譜法測定血液透析液中乳酸根的含量測定方法，樣品無需前處理，不受樣品中其他組分的干擾。鐘志雄等[7]采用干灰化法和LC-SCX(3 mL)柱凈化處理樣品，建立了海產品中氟、溴、碘與硫的電導-紫外串聯檢測離子色譜法分析。離子色譜(ion chromatography，IC)在陰離子分析檢測方面極具優勢，具有簡單、快速、選擇性強等特點，在環境、食品、化妝品、醫藥、生命科學等領域得到廣泛的應用[8-9]。對于同時測定血液中乳酸根、甲酸根、溴離子、磷酸根、硫酸根5種離子的方法尚無相關報道，本文首次建立同時測定血液中乳酸根、甲酸根、溴離子、磷酸根、硫酸根5種無機陰離子的含量測定方法。

高血脂癥是一種全身性疾病，主要危害是導致動脈粥樣硬化，進而導致眾多的相關疾病[10-11]，學者多有研究微量元素與高脂血癥的關系[12-15]。銅、鉻和硒是高血脂癥的危險因素。鋅水平的降低可能會加劇機體脂質過氧化、促進肝細胞脂肪變性。已有的研究多集中在金屬元素上，而硫元素、磷元素、溴元素等元素及小分子有機酸在高脂血癥過程中的變化尚未有相關研究。本實驗以高脂血癥金黃地鼠為研究對象，建立同時測定血液中乳酸根、甲酸根、溴離子、磷酸根、硫酸根5種離子含量的離子色譜方法，為高脂血癥等疾病發生過程中5種離子含量變化的研究提供方法支撐。

1 儀器和材料

1.1 儀器

日本日立7060 型全自動生化分析儀、DIONEX ICS-1000離子色譜儀(包括Chromeleon 7色譜工作站)、德國SIGMA 3K15離心機、KQ5200DV型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、AL204萬分之一電子天平(梅特勒-托利多上海有限公司)。

1.2 材料

碳酸鈉(Sigma公司，純度≥99.5%)，碳酸氫鈉(Sigma公司，純度≥99.7%)，血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為15081，150721，150531，150861)，乳酸(西隴化工股份有限公司，批號：141212，純度：99.0%)，甲酸鈉(天津市光復精細化工研究所，批號：20150310，純度：99.5%)，溴化鉀(天津光復精細化工研究所，批號：20140418，純度：99.0%)，磷酸鈉(天津市光復精細化工研究所，批號：20150608，純度：99.0%)，硫酸鈉(天津市光復精細化工研究所，批號：20150610，純度：99.0%)，Dionex On GuardTMII RP小柱(美國Thermo，批號：170213-1-RP)。

1.3 動物與飼料

90～120 g金黃地鼠，生產許可證號：SCXY(京)2012-0001，70只，雄性，SPF級，購于北京華阜康生物科技股份有限公司。金黃地鼠高脂飼料(15% 豬油，0.2% 膽固醇，84.8%基礎飼料)購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 高脂血癥金黃地鼠模型建立

2.1.1 飼養條件 金黃地鼠適應性喂養一周后按體重隨機分為正常組、高脂血癥模型組各3組。動物于SPF條件環境中飼養，溫度(21±2)℃，相對濕度(50±5)%，光照周期：12/12 h，10只/籠，正常組給予基礎飼料，高血脂模型組給予50%高脂飼料+50%基礎飼料，動物自由攝食、飲水。

2.1.2 樣品的采集 分別于造模前及造模第10天、20天、30天處理正常組和模型組各一組，乙醚麻醉后眼眶靜脈叢取血兩管，一管為促凝管，以離心分離血清，用于血脂四項的測定；另一管為肝素抗凝管，以離心得到血漿，用于血液中5種陰離子的含量測定。

2.1.3 生化指標的測定 取造模前及造模第10天、20天、30天正常組、模型組的血清樣品，使用全自動生化分析儀采用試劑盒法測定TC、HDL-C、LDL-C、TG的值。表1結果表明建模20 d后，相比于正常組，模型組血清總膽固醇(CHO)、TG、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)顯著升高，金黃地鼠高脂模型建立；至第30天，模型組CHO、TG、LDL顯著高于正常組，且基本穩定在一個較高的范圍。

表1 金黃地鼠血清生化指標測定結果 mmol·L-1

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；下同。

2.2 離子色譜法的建立

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取1.677 g十水硫酸鈉于500 mL容量瓶中加水定容，配成10.2 mmol·L-1硫酸根標準儲備液；精密稱取2.000 g十二水磷酸鈉于500 mL容量瓶中加水定容，配成10.5 mmol·L-1磷酸根標準儲備液；精密稱取1.345 g乳酸鈉于500 mL容量瓶中加水定容，配成11.1 mmol·L-1乳酸根標準儲備液；精密稱取3.110甲酸鈉于500 mL容量瓶中加水定容，配成22.7 mmol·L-1甲酸根標準儲備液；精密稱取1.700 g溴化鉀于500 mL容量瓶中加水定容，配成12.5 mmol·L-1溴離子標準儲備液。

2.2.2 樣品溶液的制備 取2.1.2項下血漿樣品，精確量取0.4 mL置于10 mL離心管中，加入1 mL乙腈沉淀蛋白質后加入8 mL去離子水，振蕩，混勻，5 min后離心10 min(10 000 r·min-1)，過活化好的RP小柱收集后流出的5 mL濾液，過0.22 μm濾膜，取續濾液1 mL。

2.2.3 色譜條件 IonPac AS23 離子交換柱(250 mm×4 mm)、IonPac AS23保護柱(50 mm×4 mm)、ASRS300-4mm抑制器，淋洗液濃度：4.5 mmol·L-1碳酸鈉和0.8 mmol·L-1碳酸氫鈉，流速：1 mL·min-1，進樣時間：180 s；ASRS 4 mm陰離子抑制器，加電自動抑制，抑制溫度：19 ℃，抑制電流：19 mA；電導檢測器，檢測池溫度：36 ℃，柱溫室溫，進樣量：25 μL。

2.2.4 專屬性試驗 取血漿樣品，按照2.2.2項樣品處理方法制備樣品溶液，按照2.2.3項下色譜條件，樣品溶液進樣分析。

2.2.5 線性關系及最低檢出限試驗 精密稱取32 mL乳酸根儲備液、0.2 mL甲酸根儲備液、0.2 mL溴離子儲備液、4 mL磷酸根儲備液、3 mL硫酸根儲備液至100 mL容量瓶，加水定容至刻度，配制成乳酸根3.5 mmol·L-1、甲酸根0.045 mmol·L-1、溴離子0.025 mmol·L-1、磷酸根0.42 mmol·L-1、硫酸根0.30 mmol·L-1的混合對照品溶液，然后依次對半稀釋，得到系列混合對照品溶液。

分別吸取乳酸根離子、甲酸根離子、溴離子、磷酸根、硫酸根系列混合對照溶液1 mL，注入離子色譜儀，按照上述色譜條件分離，測定。以峰面積為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。將混合對照品溶液依次稀釋至不同濃度，按照2.2.3項的色譜條件分別檢測。以信噪比3∶1作為檢測限，計算乳酸根離子、甲酸根離子、溴離子、磷酸根、硫酸根的檢出限。空白色譜圖、樣品色譜圖、對照品色譜圖見圖1，線性關系及檢測限見表2。

注：A.空白；B.樣品；C.對照品；1.乳酸根；2.甲酸根；3.溴離子；4.磷酸根；5.硫酸根。圖1 對照品及金黃地鼠血漿樣品離子色譜圖

表2 金黃地鼠血漿中5種陰離子的線性方程

2.2.6 精密度試驗 將乳酸根離子、甲酸根離子、溴離子、磷酸根、硫酸根混合對照品溶液連續進樣6次，分別計算5種離子平均色譜峰面積的RSD為1.6%、2.7%、2.4%、2.2%、1.8%。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密量取已知濃度的血漿樣品 6 份，各0.2 mL，分別精密加入0.2 mL一定濃度的混合對照品，按2.2.2項下的方法制備供試品溶液，進樣10 μL測定，通過對照品加入量和實際測定的含量計算其回收率，結果見表3。

表3 金黃地鼠血漿中5種陰離子測定的回收率試驗結果

2.2.8 穩定性試驗 取一份血漿樣品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定，記錄乳酸根離子、甲酸根離子、溴離子、磷酸根、硫酸根的峰面積，計算RSD分別為0.2%、2.6%、1.4%、0.9%、0.2%。結果表明供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.3 數據統計與分析

2.4 血液中5種陰離子濃度測定結果

表4結果顯示，正常組30 d內血液中乳酸根濃度范圍為15.24～15.95 mmol·L-1，模型組濃度范圍為12.85～15.75 mmol·L-1，較正常組逐漸降低。建模第10天，模型組與正常組乳酸根濃度無統計學差異；建模第20天，模型組乳酸根濃度顯著降低(P<0.05)；建模第30 d，模型組乳酸根濃度更低，與正常組差異增大。甲酸根正常組30 d內濃度范圍為0.06～0.11 mmol·L-1，模型組濃度范圍為0.05～0.11 mmol·L-1。建模第10天，模型組濃度低于正常組(P<0.05)；建模第20、30天，模型組與正常組無統計學差異。溴離子正常組30天內濃度范圍為0.10～0.12 mmol·L-1，模型組濃度范圍為0.10～0.12 mmol·L-1，建模第10、20、30天正常組和模型組濃度均無統計學差異。正常組30 d內磷酸根濃度范圍為0.83～1.47 mmol·L-1，模型組濃度范圍為0.87～1.47 mmol·L-1，建模第10天，模型組和正常組無統計學差異；建模第20天，模型組顯著低于正常組(P<0.05)；建模第30天，模型組濃度顯著高于正常組(P<0.001)。硫酸根正常組30 d內濃度范圍為0.79～1.05 mmol·L-1，模型組濃度范圍為0.79～0.88 mmol·L-1，建模第10天，模型組與正常組無統計學差異；建模第20天，模型組與正常組無統計學差異；建模第30天，模型組顯著低于正常組(P<0.05)。

表4 金黃地鼠血液中5種陰離子濃度測定結果 mmol·L-1

3 討論

研究高血脂可選擇的模型動物有很多，其中金黃地鼠脂蛋白結構與人類相似，其肝臟內源性膽固醇合成比例約為 85%，相比其他實驗動物與人類更為接近，是目前較為公認的模型動物，本實驗用高脂飼料喂養金黃地鼠，造模20 d，即可得到較為穩定的高脂血癥模型。測得高血脂癥模型組相比于正常組，血脂4項中TC、TG、LDL逐漸升高，并維持在一個較高的水平，為血液中陰離子的含量測定提供了良好的基礎。與楊康敏[16]分別對短、中、長期(4、21、42周)高脂血癥模型組造模前和造模后第1～42周血脂水平進行動態連續監測的研究結論基本一致。

血液中乳酸根、甲酸根、磷酸根、硫酸根在高血脂癥形成的過程中發生了一定的變化，血液中乳酸根、硫酸根含量較正常組逐漸降低，磷酸根含量較正常組逐漸升高。模型組與正常組血液中甲酸根離子含量變化無統計學差異。模型組和正常組血液中溴離子基本保持穩定，兩組之間無統計學差異。正常組血液中乳酸根含量基本穩定，模型組逐漸降低，在建模20、30 d顯著降低。Wang等[17]研究表明高脂血癥模型大鼠與對照組相比較乳酸、檸檬酸等的水平顯著降低，乳酸的減少表明葡萄糖代謝途徑的改變，導致有氧代謝或脂質合成增強。乳酸的減少將使葡萄糖代謝途徑轉變為脂質合成。正常組血液磷酸根逐漸降低，孫成亮[18]研究表明，隨著年齡的增加，血鈣、血磷的濃度會出現下降的趨勢，血磷在幼年時含量較高與幼年時成骨發育活動強有關。模型組較正常組逐漸升高，建模30 d后與正常組有統計學差異，較高血清磷酸根是增加心力衰竭發生率的獨立危險因素[19]，高脂血癥發病時所引起的血液磷酸根水平上升，是心血管疾病的危險因素，增加了冠心病、心力衰竭的可能性。正常組血液硫酸根逐漸升高，硫酸鹽在生長發育中有重要的作用，Qi等[20]發現制備高硫酸鹽含量衍生物(HU)，比綠藻(ulvan)有更高的抗高血脂活性，提示高硫酸鹽具有促進脂質代謝的作用。本實驗中模型組較正常組血液中硫酸根含量顯著降低。甲酸根正常組變化波動較大，模型組血液中甲酸根在30 d顯著高于正常組，關于血液中甲酸根含量變化與高脂血癥的關系需要進一步研究。

血液樣品因含有較多的大分子物質，一般需經過一系列的前處理，唐磊等[21]用乙腈沉淀血液中的蛋白質后依次過 C18柱、Ag柱和Na柱，用于去除其中的有機物和氯離子后進行離子色譜檢測。Bowling等[22]使用Dionex ICS2000通過離子色譜法測量血漿和尿中硫酸鹽，使用抑制電導檢測。本研究在預試驗過程中發現以2.2.3中色譜條件進樣，氯離子在7.4 min出峰，與其他待測峰不存在干擾，所測5種離子得到良好分離，因此確定前處理方法為高血脂癥金黃地鼠血樣經乙腈沉淀蛋白，過Dionex On GuardⅡRP柱，過0.22 μm微孔濾膜后取續濾液進樣，相比常規方法省去了過Ag柱和Na柱的處理，節省了成本。本文建立了同時測定血液中5種離子含量的方法，5種陰離子達到基線分離，線性關系良好，r為0.999 1～0.999 9，加樣回收率和儀器精密度(RSD<3.0%)等良好。方法簡便、快速、靈敏度高，可以用于高脂血癥血液中5種陰離子的含量測定。

本文初步研究了高脂血癥等疾病發生過程中乳酸根、甲酸根、溴離子、磷酸根、硫酸根含量變化，高脂血癥發病過程中，血液中乳酸根含量不斷下降，磷酸根含量偏高，硫酸根含量降低，溴離子、甲酸根變化不大。建立的離子色譜法可為高脂血癥等疾病發生過程中乳酸根、甲酸根、溴離子、磷酸根、硫酸根含量變化的研究提供方法支撐。

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