PEI-Fe3O4納米顆粒載siRNA向人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT的遞送

陳佳玉，張殿寶，李 瑩，王麗平，王浩林

(中國醫(yī)科大學(xué)1.第一臨床學(xué)院；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽110122)

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes)是人皮膚表皮層的主要組成部分，在皮膚表皮的穩(wěn)態(tài)維系和創(chuàng)面修復(fù)中起關(guān)鍵性作用[1]。目前，自體角質(zhì)形成細(xì)胞的體外培養(yǎng)與移植技術(shù)已應(yīng)用于臨床。單獨(dú)使用角質(zhì)形成細(xì)胞仍然在細(xì)胞歸巢、移植方式和細(xì)胞存活等方面面臨挑戰(zhàn)，而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾已成為基因治療的新途徑。常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如病毒法、脂質(zhì)體法和電穿孔法等)存在安全性和穩(wěn)定性等問題，迄今也無高效穩(wěn)定的臨床級(jí)核酸遞送技術(shù)[2]。本研究使用PEI-Fe3O4超順磁納米顆粒載siRNA向人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行遞送，為角質(zhì)形成細(xì)胞的siRNA遞送尋找新方法，以期應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 材料:人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT(ATCC)，貼壁增殖，呈鋪路石樣；PEI-Fe3O4納米顆粒(東納生物公司)；DMEM培養(yǎng)液和FBS(Hyclone公司)；siRNA(吉瑪基因公司)；Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司)；CCK- 8試劑盒(Dojindo公司)。

1.2 方法

1.2.1 PEI-Fe3O4納米顆粒的表征：使用透射電鏡(120.0 kV)觀察納米顆粒的形態(tài)和大小，透射電子顯微鏡樣品制備依文獻(xiàn)方法進(jìn)行[3]。使用動(dòng)態(tài)光散射檢測納米顆粒的流體動(dòng)力學(xué)大小和Zeta電位。

1.2.2 siRNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)：將siRNA NC(negative control，陰性對(duì)照) 1 μg按納米顆粒/siRNA質(zhì)量比為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.2混合，加opti-MEM培養(yǎng)基至20 μL，室溫放置30 min后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，使用Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)觀察并成像。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染：將HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，按1×105細(xì)胞/孔接種6孔板并培養(yǎng)過夜。將納米顆粒與GAPDH siRNA按4 μg/1 μg、8 μg/1 μg、8 μg/2 μg和8 μg/4 μg的比例混合，室溫孵育15 min后加入細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后換液。siRNA序列：siRNA NC：5′-UCCG AACGUGUCACGUTT-3′；GAPDH siRNA：5′-GUAUGACAACA GCCUCAAGTT-3′。

1.2.4 Real-time PCR檢測靶基因的mRNA：使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，使用SYBR Green realtime PCR試劑盒在ABI 7500 PCR系統(tǒng)中擴(kuò)增。以ACTB為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。引物序列如下：GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′；ACTB上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGGA-3′，下游引物5′-CTAAGTCAT AGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.2.5 普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞對(duì)納米顆粒/siRNA復(fù)合物的攝取：使用4%甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，用PBS洗3次。將12%鹽酸與4%亞鐵氰化鉀等體積混合配制普魯士藍(lán)染液。將細(xì)胞使用普魯士藍(lán)染液室溫孵育30 min，核固紅復(fù)染10 min，使用倒置相差顯微鏡觀察并成像。

1.2.6 細(xì)胞毒性的檢測：將細(xì)胞接種96孔板，納米顆粒和siRNA按0.27 μg/0.07 μg轉(zhuǎn)染siRNA NC，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。使用iMARK酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度。

2 結(jié)果

2.1 PEI-Fe3O4納米顆粒的表征: 透射電鏡下PEI-Fe3O4納米顆粒呈致密的球狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑為12 nm(圖1)。動(dòng)態(tài)光散射檢測到納米顆粒的水動(dòng)力學(xué)半徑為18.34 nm，Zeta電位為+36.2 mV。

圖1 透射電鏡表征PEI-Fe3O4納米顆粒Fig 1 PEI-Fe3O4 nanoparticles were characterized by TEM

2.2 siRNA凝膠阻滯實(shí)驗(yàn):若siRNA與納米顆粒形成了復(fù)合物，則不會(huì)在凝膠中遷移。隨著納米顆粒/siRNA質(zhì)量比增大，條帶逐漸變?nèi)酰?dāng)該比例達(dá)到1.2時(shí)siRNA被完全阻滯(圖2)。

圖2 PEI-Fe3O4納米顆粒對(duì)siRNA的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)Fig 2 Gel retardation assay for PEI-Fe3O4 nanoparticles against siRNA

2.3 PEI-Fe3O4納米顆粒載siRNA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞基因沉默的效率:處理24 h后，可見納米顆粒與siRNA質(zhì)量比影響沉默效率，當(dāng)使用納米顆粒8 μg和siRNA 2 μg時(shí)高達(dá)80%(圖3)。

*P<0.05 compared with con group

2.4 普魯士藍(lán)染色檢測細(xì)胞對(duì)納米顆粒/siRNA復(fù)合物的攝取:對(duì)使用8 μg納米顆粒和2 μg siRNA處理12 h的細(xì)胞進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，視野中所有細(xì)胞都有藍(lán)色著色(圖4)。

圖4 普魯士藍(lán)染色檢測細(xì)胞對(duì)納米顆粒/siRNA復(fù)合物的攝取Fig 4 Cellular uptake of the nanoparticles/siRNA was detected by Prussan blue staining

2.5 納米顆粒對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響:每孔0.27 μg納米顆粒和0.07 μg siRNA轉(zhuǎn)染24 h，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在450 nm處的吸光度分別為1.28±0.14和1.19±0.17。

3 討論

本研究中使用PEI-Fe3O4超順磁納米顆粒向人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞遞送siRNA，使其發(fā)揮基因沉默的作用。通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，檢測了正電性的納米顆粒與帶有負(fù)電荷的siRNA分子在不同質(zhì)量比的條件下形成復(fù)合物的情況，結(jié)果表明當(dāng)納米顆粒/siRNA質(zhì)量比達(dá)到1.2時(shí)，siRNA被完全阻滯，說明所有siRNA與納米顆粒形成復(fù)合物。由于細(xì)胞主要通過內(nèi)吞作用攝取納米顆粒[3]，納米顆粒的電性影響其與負(fù)電性的細(xì)胞膜相互吸引，而siRNA與納米顆粒形成復(fù)合物將中和納米顆粒的正電荷，因此需要研究確定納米顆粒和siRNA的比例及用量，以達(dá)到最佳沉默效率。在沉默效率的結(jié)果中，6孔板每孔使用8 μg納米顆粒和2 μg siRNA時(shí)效率高達(dá)80%，并且該濃度對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，說明該納米顆粒能夠有效地載siRNA對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行基因沉默。本研究中使用的納米顆粒轉(zhuǎn)染法為解決病毒法安全性差、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體內(nèi)穩(wěn)定性差和電穿孔轉(zhuǎn)染效率低等問題提供了新的思路和解決方案。

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[1] Lewis CJ, Mardaryev AN, Poterlowicz K,etal. Bone morphogenetic protein signaling suppresses wound-induced skin repair by inhibiting keratinocyte proliferation and migration[J]. J Invest Dermatol, 2014, 134:827- 837.

[2] Majidi S, Zeinali Sehrig F, Samiei M,etal. Magnetic nanoparticles: Applications in gene delivery and gene therapy[J]. Artif Cells Nanomed B, 2016, 44:1186- 1193.

[3] Zhang D, Wang J, Wang Z,etal. Polyethyleneimine-coated Fe3O4nanoparticles for efficient siRNA delivery to human mesenchymal stem cells derived from different tissues[J]. Sci Adv Mater, 2015, 7:1058- 1064.