超高效液相色譜—串聯四極桿復合線性離子阱質譜法同時識別和測定尿液中毒死蜱代謝物

宋寧慧 徐懷洲 吉貴祥 張圣虎 張芹 郭敏 石利利

摘 要 建立了超高效液相色譜-串聯四極桿復合線性離子阱質譜（Ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry， UPLC-QTRAP）技術結合QuEChERS（Quiek， Easy， Cheap， Effective， Rugged， and Safe）法檢測尿樣中毒死蜱代謝產物殘留的分析方法。采用乙腈提取，PSA和BCB凈化，ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱分離，以乙腈-0.2%氨水為流動相梯度洗脫，在電噴霧電離（ESI負離子模式下），使用觸發增強子離子掃描方式（MRM-IDA-EPI）對尿樣中毒死蜱的代謝產物進行定性和定量分析。方法線性范圍為1.0～100.0 μg/L，檢出限0.10～0.73 μg/L。尿樣中3種毒死蜱代謝物的平均加標回收率在80.3%～90.1%之間， RSD均小于5%。本方法操作簡單、靈敏度高、準確性好、重現性強，利用QTRAP的質譜優勢可有效的對色譜峰進行鑒定，有效預防樣品的假陽性。本方法已成功應用于人體尿液實際樣品中，檢出的濃度范圍為ND～54.6 μg/L。本方法可為復雜基質中化學品的識別和定量提供技術參考。

關鍵詞 毒死蜱； 代謝產物； 超高效液相色譜-串聯四極桿離子阱質譜； 尿樣

1 引 言

毒死蜱（Chlorpyrifos），化學品名O，O-二乙基-O-（3，5，6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸，屬于有機磷類殺蟲劑。由于毒死蜱對哺乳動物急性毒性中等且在環境中的持久性較低，因此廣泛用于我國農作物病蟲害和家庭衛生害蟲的防治。然而，毒死蜱的大量使用也會引發人和動物產生多種毒性反應[1，2]。

毒死蜱的急性暴露會導致神經毒性的發生，抑制乙酰膽堿酯酶活性，使神經纖維長期處于興奮狀態，正常的神經傳導受阻，引發膽堿能綜合癥[2]。毒死蜱被人體吸收后，主要分布在肝臟、腎臟、脾臟等血流量較高的器官，經脂酶分解成一系列代謝產物[3～5]，包括3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-Trichloro-2-pyridinol， TCP）、二乙基硫代磷酸酯（Diethyl thiophate， DETP）、二乙基磷酸酯（Diethyl phosphate， DEP），其結構式見圖1。其中TCP是毒死蜱在人體中經腎臟排泄的最主要的代謝產物，具有抑制人體乙酰膽堿酯酶活性的作用，因此，人尿液中TCP的濃度是人體毒死蜱生物負荷的一個特異性生物監測指標，可反映毒死蜱這種外源性污染物質對人體產生的危害，如抑制人體紅細胞乙酰膽堿酯酶活性以及導致血色素濃度下降等[6～8]。TCP在代謝過程中很大程度被軛合[9]。因此，尿樣中含有烷基（含硫）磷酸酯和醇的碎片更具有化合物的特異性，并且測定DEP和DETP的濃度比例可以對有機磷農藥代謝物的來源進一步確證，可作為人體毒死蜱生物負荷的特異性生物監測指標。

隨著質譜技術的發展，檢測尿液中毒死蜱代謝產物的分析方法主要有氣相色譜-質譜法[10～12]和液相色譜-質譜法[12～14]。氣相色譜法前處理時需要衍生化，過程較為繁瑣。高效液相色譜法前處理較為簡單[12]。但由于基質的復雜性，即使使用串聯四極桿模式也難免造成假陽性或假陰性的誤判[15]。因此需要開發靈敏度更高和選擇性更優的分析方法。

基于尿樣的基質復雜性，本實驗在優化樣品前處理方式的基礎上，采用UPLC-QTRAP的兩種采集模式，即傳統的多反應監測掃描（Multiple reaction monitoring， MRM）模式進行定量檢測和線性離子阱的增強子離子掃描模式（Enhanced product ion scanning， EPI）獲得相應的二級碎片圖進行定性確證。當使用數據依賴性獲取技術（Information dependent acquisition，IDA）時，可將兩種掃描模式相結合，即多反應監測-觸發增強子離子掃描模式（MRM-IDA-EPI），該種模式一次進樣可以同時獲得高靈敏度MRM的定量數據和二級全掃描質譜圖（EPI）進行定性確認。在不降低定性和定量分析性能的同時，既能實現準確定量特定目標化合物，又能在一次運行中高靈敏地定性鑒定化合物。使用本方法對尿樣中毒死蜱的代謝產物進行定性和定量分析，簡便快速，并將定性和定量方法有機結合在一起，可以滿足復雜基質中目標物的準確定性和定量分析要求。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜-串聯四極桿復合線性離子阱質譜（UPLC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美國）； Milli-Q超純水機（德國Millipore公司）； 高速離心機（德國Eppendorf公司）。

毒死蜱代謝產物：硫代磷酸二乙酯（DETP）、磷酸二乙酯 （DEP）、三氯吡啶醇 （TCP）和內標磷酸二丁酯（Dibutyl phosphate，DBP）標準品（純度>95%，德國 Dr. Ehrenstorfer公司）。DETP、DEP、TCP和DBP標準品用乙腈配制得1000 mg/L的儲備液。β-葡萄糖苷酸酶（5.0×106～2.0×107 units/mg protein，美國Sigma Aldrich 公司）。乙腈（色譜純，德國Merck公司）； HCl（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。分散固相萃取填料（無水Na2SO4、PSA、GCB、NaCl，美國Agilent公司）； 人體尿液由居住在江蘇省某農藥廠附近兒童（3～6歲）提供。

2.2 樣品前處理

冰凍尿樣于室溫下緩慢解凍，取10 mL于50 mL離心管中，加入4 mL HCl（6 mol/L）振蕩，于80℃水浴條件下水解2 h。取出后降至室溫。繼續在尿樣中加入10 mL乙腈溶液、3 g NaCl，渦旋1 min后，以8000 r/min離心分離，取上層5 mL乙腈，加入100 mg PSA、20 mg GCB、2 g無水Na2SO4，渦旋1 min后，濾紙過濾，收集濾液，旋蒸近干，N2吹干后，加1 mL乙腈，待LC-MS/MS測定。

2.3 色譜條件

ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）； 流動相：0.02%（V/V）氨水（A）和乙腈（B）； 線性梯度洗脫： 0～2 min，99% A； 3～6 min，70%～5% A； 6～8 min，5% A； 13～15 min，99% A。流速：0.3 mL/min； 柱溫：40℃； 進樣體積：5 μL。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI-）； 掃描模式：MRM-IDA-EPI； 離子源溫度：400℃； 離子噴霧電壓：5500 V； 氣簾氣壓力：0.207 MPa； 噴霧氣壓力：0.241 MPa； 輔助加熱氣壓力：0.276 MPa。EPI參數設置：探測掃描模式選擇負離子模式，碰撞能量CE： 10、25和40 eV； 掃描速度：4000 Da/s； 掃描閾值：1000 cps。其它參數見表1。

2.5 質量控制與保證（QA/QC）

根據離子對豐度比和保留時間定性，目標化合物通過與標樣的保留時間（2%以內）和選擇離子的豐度比與標準樣品豐度比（25%以內）比較進行定性確認，并進一步使用二級譜庫比對確證。采用內標法定量，選擇最高豐度或背景干擾最少的選擇離子進行定量分析。每一組樣品中添加1 個基質空白、1 個樣品重復和1 個基質加標回收進行質量控制。 方法空白樣品中目標化合物含量均低于檢出限。

3 結果與討論

3.1 液相色譜和質譜條件的優化

本實驗考察了ZORBAX Eclipse Plus C18（150 mm ×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX SB-CN（100 mm ×2.1 mm，3.5 μm）、ZORBAX HILIC Plus C18（100 mm ×2.1 mm， 3.5 μm）3種色譜柱。結果表明， 利用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）可將4種目標物完全分離， 且響應較高； 其它色譜柱對4種物質均不能有效分離， 因此，本實驗選用ZORBAX Eclipse Plus C18作為分離柱。在流動相的選擇中，根據目標物分子結構特征，堿性條件可以提高化合物[M-H]峰的離子響應，因此采用乙腈-0.2%氨水作為流動相，通過梯度洗脫改變流動相的極性， 使混合物得到更好的分離。

根據毒死蜱代謝物及內標物的分子結構特征，選擇電噴霧離子（ESI）源負離子模式掃描。采用半自動進樣方式，以5 μL/min 的流速將100 μg/L 的標準儲備液分別注入離子源； 分別考察了ESI全掃描在正、負離子模式下待測物峰的響應。結果表明，在負離子模式下，TCP、DEP、DETP及內標DBP的分子離子峰[M-H]分別是m/z 198、153、169和209。在較低的能量下分別對各個分子離子進行二級質譜掃描，確定目標物的特征離子峰，具體參數見表1。TCP以m/z 198為母離子，其較穩定的碎片離子只有m/z 35，且響應較弱，因此選取m/z 198為定量離子，同時選擇TCP的脫氫峰m/z 196為定性離子。

在優化的色譜和質譜條件下，建立MRM-IDA-EPI掃描模式。質譜分析選取對應的母離子峰，對其子離子進行二級質譜分析，得到碎片離子信息； 并對目標化合物二級質譜的CE、DP、EP、CXP 等質譜參數進行優化。在優化的MRM參數基礎上建立IDA的方法。其方法原理見圖2，即樣品首先通過 Q1 掃描（Q1 Scan），獲取一級質譜全掃描信息，在此基礎上通過閾值的設定，響應高于閾值的質譜峰將會被觸發（IDA），Q3 在離子阱（LIT）采集模式下，采用線性離子阱啟動增強子離子掃描模式（EPI），對其進行二級碎片全掃采集，獲得相對應的二級碎片圖。最終軟件通過母離子質荷比、子離子掃描圖譜、同位素豐度比等信息，進行未知色譜峰的結構確認。

3.2 尿液前處理過程優化

3.2.1 酶解條件的優化 尿液中毒死蜱代謝產物TCP以游離態和葡萄糖苷酸結合共軛態兩種形式存在，且部分代謝物的結合態所占比例較高，因此對樣品進行去葡萄糖苷酸的酶解處理十分必要。根據文獻[16，17]，可以使用解離酶β-葡萄糖苷酸酶或酸解鹽酸化解除TCP的軛合態。本實驗分別采用兩種方式解除TCP的軛合態：添加50 Units β-葡萄糖苷酸酶，在37℃條件下解離120 min； 添加4 mL HCl（6 mol/L）振蕩，于80℃水浴條件下水解2 h。結果表明，使用葡萄糖苷酸酶會使DEP產生基質干擾，同時基線干擾較為嚴重； 使用HCl處理，對DEP及其它代謝產物均未產生干擾（圖3），且酸解過程對目標物分子均無破壞。同時，酸解可以降低實驗成本。因此，本實驗采用添加HCl（6 mol/L）解除TCP的結合態。

3.2.2 凈化條件優化 尿液是含內源性物質較多的復雜基質。本實驗采用QuEChERS法，將凈化劑直接分散于提取液中，盡可能多地吸附干擾基質，將待檢測的目標化合物保留在溶液中。選用凈化劑PSA和GCB，PSA對有機酸、色素、糖和脂肪酸等干擾物質具有較強的吸附能力[18]； GCB主要用于去除色素，但對部分農藥組分具有一定的保留[19]，其用量需在去除色素和保證回收率之間進行優化。由圖4可知，當GCB添加量分別為5、10、20、30和40 μg時，各種農藥的回收率在54.4%～91.4%之間； 隨著GCB用量增加，各種農藥的回收率逐步降低，其中僅當GCB的用量為20 μg時，毒死蜱各代謝產物的回收率在81.6%～88.2%之間， 基本符合殘留檢測的要求。

3.3 方法學確證

3.3.1 標準工作曲線、方法靈敏度與重復性 本實驗采用內標法定量，分別配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的3種毒死蜱代謝物基質標準溶液，以峰面積（y）對目標物的質量濃度（x）繪制標準曲線，目標物在1.0～100.0 μg/L范圍內呈良好的線性關系良好（R2>0.995），以信噪比S/N=3計算方法檢出限（LOD），S/N=10作為方法定量限（LOQ），同時對50 μg/L的標準溶液連續測定5天，每天測定5次，計算日內和日間精密度。結果表明，毒死蜱各代謝產物的基質標準溶液分析重現性良好，RSD<5%（表2）。

3.3.2 方法的回收率及精密度 吸取適量混合標準工作溶液到尿樣空白（低于檢出限），配制3個濃度水平（0.5、5.0 和10 μg/L）的待測樣品，每個濃度設置3個平行樣。尿樣中TCP、DEP和DETP 3種毒死蜱代謝物的平均加標回收率分別在80.3%～84.7%、83.5%～90.0%和85.2%～90.1%之間（表3和圖5），RSD<10%，滿足農藥殘留定量分析的需求。

3.3 實際樣品的定性與定量分析

3.3.1 定性分析 本實驗所選UPLC-QTRAP系統，三重四極桿與線性離子阱技術結合，使用MRM-IDA-EPI模式對尿樣中毒死蜱的代謝產物進行定性分析，在此模式下，不僅可以通過MRM進行高靈敏定量分析，得到定性確認的二級全掃描質譜圖（EPI圖），同時可利用EPI質譜庫進行檢索。原理如圖2所示。采集了某農藥廠附近兒童的晨尿（30份），按照以上實驗方法處理樣品，并以實際樣品驗證所建立的方法。實際尿樣的檢測色譜圖見圖6，以TCP為例，將實際尿樣中檢測到的TCP和標準譜庫進行對比，匹配度高達93.372%（表4），可作為TCP定性依據。

3.3.2 定量分析 采用內標法對毒死蜱的3種代謝產物定量分析（表5），結果表明，在80%以上兒童尿液中均檢出毒死蜱代謝產物， TCP最高檢出質量濃度為54.6 μg/L。這一方面可能與農藥廠周邊人群吸入含有毒死蜱的空氣有關； 另一方面也與人群飲食攝入有關。其中DEP與DETP的質量濃度比例基本是1∶1，進一步說明了檢出的有機磷類的代謝物來自毒死蜱[20]。

4 結 論

建立了QuEChERS-UPLC-QTRAP方法用于分析人體尿液中毒死蜱的代謝產物。結果表明，本方法操作簡單，靈敏度、準確度、精密度均良好，且定性與定量分析準確，并成功應用于實際測定某農藥廠附近居民尿液中毒死蜱代謝物的含量。本方法不僅可對游離態的DETP、DEP和TCP進行定性和定量分析，而且可以用于分析TCP的總量（游離態和軛合態之和）。本方法為揭示毒死蜱在體內的代謝方式和暴露途徑、科學評價毒死蜱暴露水平與其代謝物之間的關系提供了研究基礎。

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