蝌蚪紅細(xì)胞微核試驗(yàn)在水環(huán)境污染狀況監(jiān)測中的應(yīng)用

王 剛 ，蔣 潔，常國亮，劉 洋

(1.淮陰師范學(xué)院 科技處； 2.淮安市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所 項(xiàng)目管理中心；3.淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院；4.淮陰師范學(xué)院 設(shè)備處，江蘇 淮安 223300)

國外學(xué)者曾用蔭魚[1]、銀大馬哈魚、有尾目肋螈幼體等作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[2]檢測水體污染研究；我國也有學(xué)者先后使用黃鱔、鯽魚、泥鰍、蝌蚪等作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微核試驗(yàn)，從而檢測水中致變物的致變效應(yīng)[3-5]，國外研究結(jié)果表明，運(yùn)用蝌蚪血紅細(xì)胞微核試驗(yàn)進(jìn)行水污染檢測，是比較理想、有實(shí)用價(jià)值的生物指示器，可以檢測水體中低濃度污染物[6].本人所在實(shí)驗(yàn)室以前使用蝌蚪進(jìn)行過類似的紅細(xì)胞微核試驗(yàn)，測定并報(bào)道了里運(yùn)河水以及淮安市不同區(qū)域河流水質(zhì)誘發(fā)蝌蚪紅細(xì)胞微核及核異常的研究[7-8]，本實(shí)驗(yàn)選擇從淮安市區(qū)到楚州區(qū)的3條主要河流的河水為檢測對象，采用中華大蟾蜍蝌蚪進(jìn)行紅細(xì)胞的微核試驗(yàn)，對淮安市市區(qū)到楚州區(qū)不同區(qū)域水質(zhì)污染情況進(jìn)行監(jiān)測，以進(jìn)一步了解淮安市及周邊不同區(qū)域主要水質(zhì)的污染情況和程度，從而為地方水環(huán)境的監(jiān)測和治理提供初步的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

中華大蟾蜍變態(tài)期的蝌蚪，體重0.2g左右，2016年4月初采于淮安市桃花島內(nèi)的一段未受污染的河流中.染毒前10天，置于曝氣后的自來水內(nèi)飼養(yǎng)，水體溫度保持在20～22℃.一周換水2次，每天使用磨細(xì)的飼料喂養(yǎng)一次，做試驗(yàn)時(shí)選擇處于變態(tài)期發(fā)育狀態(tài)良好蝌蚪為實(shí)驗(yàn)材料.

1.2 儀器

電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)、JNOEC XS-212-202顯微鏡、XSJ-HS電腦顯微分析系統(tǒng)(Panasonic WV-CP240攝像頭)、SARTORIUS BS423S電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司).

1.3 方法

1.3.1 藥品及其配制

1)固定液

甲醇原液(GB 683-79分析純，南京建設(shè)化學(xué)試劑廠產(chǎn)品).

2)Giemsa染色液

稱取Giemsa粉(Q/GHSC 1092-97，上海試劑三廠產(chǎn)品)0.25g，甘油(GB687-77化學(xué)純，上海制皂廠出品，上海化學(xué)試劑采購供應(yīng)站試劑廠分裝)16.5mL，甲醇16.5mL.首先將少量甘油倒入Giemsa粉中，使用研缽研磨至無顆粒，再將剩余的甘油全部倒入，最后將甲醇加入并混勻，用濾紙過濾.將混合液放在56℃水浴2h使其充分溶解.用時(shí)取1mL加19mL 1/15mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.81)即成15%的Giemsa染液.

3)1/15mol/L磷酸緩沖液(pH=6.81)

稱取0.272g KH2PO4(GB1274-77化學(xué)純，上海試劑二廠產(chǎn)品)，稱取0.716g Na2HPO4·12H2O(GB1263-77分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠產(chǎn)品)，加蒸餾水60mL，混勻即可.

1.3.2 采水及預(yù)處理

對照組為經(jīng)暴氣后的淮安市自來水，A處為淮安市區(qū)里運(yùn)河(淮海路段與黃河路交叉點(diǎn))；B處為淮安市開發(fā)區(qū)古淮河水(大同路和水渡口大道交叉點(diǎn))；C處為淮安市楚州區(qū)城區(qū)文渠水(大八字橋至北水關(guān)段)；D處為淮安市楚州區(qū)城區(qū)蕭湖水(河堤東側(cè))；采水時(shí)間為2016年6月；水樣預(yù)處理方法為自然沉淀后待用.

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組

對照組為經(jīng)暴氣后的淮安市自來水，實(shí)驗(yàn)組用A、B、C、D四組水樣，每一組水樣均分為原樣100%、50%、33.3%三個(gè)濃度，用暴曬后的自來水配置，飼養(yǎng)密度每組20只/300ml.

1.3.4 染毒

選擇來源相同，發(fā)育狀況體重相似的蝌蚪隨機(jī)放入每一試驗(yàn)水樣中.每組投放20只蝌蚪，染毒時(shí)間均為一周，染毒一周后，蝌蚪全部存活，轉(zhuǎn)移到經(jīng)暴氣后的自來水中，6h后處死制血涂片.每一濃度中隨機(jī)取6到10只蝌蚪進(jìn)行處理.每一組中，挑選20只來源相同，發(fā)育情況、體重、個(gè)頭等基本情況一致的蝌蚪隨機(jī)放入試驗(yàn)水樣中.染毒一周后蝌蚪全部存活，然后，將蝌蚪全部放入經(jīng)過暴曬的自來水，靜養(yǎng)6h，并從每一種濃度中挑選6-10只處死，制作血涂片，以便實(shí)驗(yàn)使用.

1.3.5 血涂片的制備

取蝌蚪，用紗布將其體表的水分吸干(防止血細(xì)胞破裂)，在軀干和尾巴連接處斷尾，取血，涂片，自然晾干，用甲醇固定液固定15min，15%的Giemsa染液染色15min，流水沖洗后用電熱吹風(fēng)機(jī)吹干[9].

1.3.6 數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果分析

將做好的血涂片置于顯微鏡底下進(jìn)行觀察，尋找涂片均勻區(qū)域，每張片子需要觀察2000個(gè)細(xì)胞，觀察后記錄微核和核異常細(xì)胞數(shù)量.結(jié)果統(tǒng)計(jì)時(shí)，使用千分率(‰)表示.微核試驗(yàn)中鑒定微核及核異常方法參考有關(guān)文獻(xiàn)[10].

微核細(xì)胞率=具有微核的細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰；

核異常細(xì)胞率=具有核異常(除微核)的細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×1000‰；

將以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均做統(tǒng)計(jì)學(xué)方面分析(獨(dú)立性檢驗(yàn))[11].

2 結(jié)果與分析

不同區(qū)域水質(zhì)對蝌蚪紅細(xì)胞微核的影響結(jié)果見表1.

從表1可知，生活在對照組中的蝌蚪，其紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率為0.112‰；A、B、C、D原液四組水質(zhì)引起蝌蚪紅細(xì)胞的微核細(xì)胞率分別為0.386‰、0.625‰、1.475‰、0.224‰，它們分別是對照組的3.44、5.58、13.17、2.00倍，與對照組相比較，除D組外，A組有顯著性差異(P<0.05)，B、C組都有極顯著性差異(P<0.01)(見圖1).

圖1 不同區(qū)域水質(zhì)誘發(fā)蝌蚪紅細(xì)胞微核細(xì)胞率的比較

不同區(qū)域水質(zhì)對蝌蚪紅細(xì)胞核異常的影響見表2.從表2可知，對照組的蝌蚪紅細(xì)胞核異常細(xì)胞率為0.441‰，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組原液的核異常細(xì)胞率分別為2.053‰、3.026‰、3.475‰、1.162‰，它們分別是對照組的4.66、6.86、7.88、2.63倍，與對照組比較，除D組楚州城區(qū)蕭湖水與對照組無差異(P>0.05)外，A組有顯著性差異(P<0.05)，B、C組都有極顯著性差異(P<0.01) (見圖2).

3 討論

微核試驗(yàn)(micronucleus test， MN)是依據(jù)環(huán)境污染物能夠引起細(xì)胞DNA損傷、誘發(fā)染色體畸變，從而在細(xì)胞核外形成微核的道理，以便檢測污染物中誘變物質(zhì)對染色體損傷的一種簡單可行的方法.其原理是由于外源物質(zhì)的干擾，染色體發(fā)生斷裂，在細(xì)胞分裂過程無著絲點(diǎn)的染色體斷片，無法正常進(jìn)入到子細(xì)胞中，這樣在細(xì)胞核外就產(chǎn)生了微小的核，涂片染色后，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞微核率，檢測染色體受損傷的程度，從而間接反映化學(xué)物的遺傳毒性.

本實(shí)驗(yàn)之所以選擇蝌蚪作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是因?yàn)樗哂腥缦?個(gè)優(yōu)點(diǎn)：(1)蝌蚪易于采集，數(shù)量較多，基本上無成本，且易于觀察和實(shí)驗(yàn).(2)蝌蚪紅細(xì)胞體積較大，分裂旺盛，對環(huán)境污染物反應(yīng)相當(dāng)靈敏.(3)蝌蚪對環(huán)境質(zhì)量變異極其敏感，因?yàn)轵蝌襟w表很薄、與水體完全接觸，且沒有保護(hù)性的隔離(如魚的鱗片、昆蟲的殼等)結(jié)構(gòu).(4)蝌蚪體內(nèi)因?yàn)閾碛修D(zhuǎn)化前誘變劑或前致癌劑為具有活性成分的微粒體活性系統(tǒng)，除了對檢測水體中的直接致突變物有較好適用性外，還可以檢測水體中的前致突變物[12].(5)蝌蚪微核試驗(yàn)對水中單因子致突變效應(yīng)和污水中混合污染物的聯(lián)合致突變效應(yīng)都具有較好的適用性，擁有很高的實(shí)用價(jià)值[13].

表2 不同區(qū)域水質(zhì)引起蝌蚪紅細(xì)胞的核異常比較

圖2 不同區(qū)域水質(zhì)誘發(fā)蝌蚪紅細(xì)胞核異常細(xì)胞率的比較

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)河水誘發(fā)蝌蚪血紅細(xì)胞微核率呈現(xiàn)不同的特點(diǎn).從表1可以看出， C組(淮安區(qū)城區(qū)文渠原液)微核率最高，達(dá)1.475‰，為對照組的13.17倍，二者差異極顯著(P<0.01)；A(市區(qū))、B(開發(fā)區(qū))組(均為原液)次之，其微核率分別為 0.386‰、0.625‰，與對照組相比， A組有顯著性差異(P<0.05)，B組都有極顯著性差異(P<0.01)；D組微核率為0.224‰，與對照組相比無明顯差異(P>0.05).據(jù)查，四條河水污染程度不同主要是因?yàn)檠匕段廴驹捶植疾灰?C組(楚州城區(qū)文渠河)是環(huán)城的一條主干河流，人口密集，居民眾多，排入此河流的污染源主要有生活垃圾和糞便以及一些工廠排放的工業(yè)廢水、廢渣和廢氣，從而造成河水的嚴(yán)重污染；B(開發(fā)區(qū))組河水污染程度處在市區(qū)里運(yùn)河與城區(qū)文渠河之間；A組(市區(qū)里運(yùn)河)從市區(qū)穿過，地處經(jīng)濟(jì)繁華地帶，城市生活污水成分復(fù)雜，有生活日常垃圾和糞便、洗滌劑以及各種病原微生物等，并且此處有排污口，污水源源不斷向河中排放；D組(蕭湖)是位于淮安城區(qū)蕭湖公園的一條河流，污染相對少一些.生活污水中的各種成分聯(lián)合作用導(dǎo)致了蝌蚪紅細(xì)胞的致突效應(yīng).首先，各種有機(jī)污染物的降解，需要消耗水中溶解氧氣，直接造成水中缺氧，從而造成影響蝌蚪生長緩慢等情況，誘發(fā)蝌蚪體內(nèi)染色體受損而產(chǎn)生微核；其次，在降解不飽和脂肪酸自身氧化過程中，會(huì)產(chǎn)生大量游離原子團(tuán)、過氧化物、氫氧化物等，這些物質(zhì)氧化性很強(qiáng)，攝入這些污染物，可引發(fā)蝌蚪產(chǎn)生微核與核異常[14].研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的河水致變蝌蚪血紅細(xì)胞微核率不同.置于對照組中的蝌蚪，紅細(xì)胞微核率僅為0.112‰，不同濃度河水水質(zhì)處理后，微核率的上升幅度與濃度成正比，濃度越高，微核率越高.淮安城區(qū)文渠組1/3稀釋度微核率為0.172‰；1/2稀釋度微核率升高為0.286‰；而原液組微核率高達(dá)1.475‰，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞除產(chǎn)生微核外，同時(shí)出現(xiàn)了其他方面的核異常.核異常包括核質(zhì)外凸、核固縮、核內(nèi)凹、核變形、無核、雙核、核碎裂、核內(nèi)空泡、無絲分裂及小核等，是一種綜合性的核損傷指標(biāo).實(shí)驗(yàn)表明在試驗(yàn)組微核率較高，出現(xiàn)核異常率亦較高.與此同時(shí)，我們還在微核率高的組中發(fā)現(xiàn)雙微核和三微核等現(xiàn)象，這從某種程度上反映出遺傳物質(zhì)損傷的加重.該現(xiàn)象表明，核異常和多微核也可以作為檢測致變效應(yīng)的指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，淮安市區(qū)到淮安區(qū)的3條主要河流(市區(qū)里運(yùn)河、開發(fā)區(qū)河水、淮安城區(qū)文渠水)的河水均含一定量的致突變活性物質(zhì)，并且3個(gè)地區(qū)的河水的含量呈現(xiàn)出遞增趨勢，尤以淮安城區(qū)水體致突變性最高.這3條主要河流致變物的含量已經(jīng)在一定程度上對沿岸百姓生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了威脅，希望地方環(huán)保部門、有關(guān)廠商及時(shí)采取相關(guān)治理措施，迅速改善地方水質(zhì)，為當(dāng)?shù)厝嗣裉峁┙】档谋ＷC.

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