紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵工藝優(yōu)化

王萬程WANG Wan-cheng 趙玲艷 - 鄧放明 -

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

鹽漬辣椒汁是剁辣椒鹽漬過程中滲出的汁液，經(jīng)測定其中蛋白質(zhì)含量約為0.73 g/100 mL、總糖含量約為3.46 g/mL、氨基酸態(tài)氮含量約為0.07 g/100 mL、氯化鈉含量約為24.93 g/100 mL、可溶性無鹽固形物含量約為7.61 g/100 mL，具有獨特的辣椒制品風(fēng)味[1]。目前，大多數(shù)企業(yè)都把鹽漬辣椒汁作為污水排放，這不僅造成大量營養(yǎng)物質(zhì)流失，而且對環(huán)境造成污染。為了利用好鹽漬辣椒汁，盧星軍等[2]對鹽漬辣椒汁的成分進行了分析，并研究了風(fēng)味辣椒汁的加工；唐鑫[1]利用鹽漬辣椒汁，制作出了一種新型腌制菜調(diào)香料；李明浩等[3]利用鹽漬辣椒汁代替普通鹽水生產(chǎn)了剁椒坯鹽水醬油；唐鑫等[4-5]將鹽漬辣椒汁作為基質(zhì)設(shè)計了植物乳桿菌培養(yǎng)基，并對其培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。雖然有關(guān)鹽漬辣椒汁應(yīng)用有一些研究，但相對于其巨大的排放量，利用程度還遠遠不夠。

發(fā)酵剁辣椒因其獨特的風(fēng)味而深受消費者的喜愛，發(fā)酵過程中乳酸菌起到了至關(guān)重要的作用，研究[6]表明乳酸菌不僅使產(chǎn)品味美爽口，同時它還具有平衡腸道菌群、提高食物消化率、降低膽固醇等功效，進而促進了人體健康。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒食品一般采用自然發(fā)酵或單一菌種發(fā)酵，存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、酶系不全、氨基酸態(tài)氮含量低、風(fēng)味不佳等問題。有研究[7]發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌發(fā)酵相比于自然發(fā)酵可顯著縮短發(fā)酵時間。有關(guān)發(fā)酵辣椒利用多菌種接種發(fā)酵的研究也有一些報道，如邵偉等[8]對多菌種混合發(fā)酵酢辣椒的工藝進行了初探；謝麗源[9]利用多菌種的協(xié)同作用，采用固態(tài)低鹽發(fā)酵方式生產(chǎn)豆瓣辣醬；沈暢萱等[10]為提高發(fā)酵辣椒工業(yè)的生產(chǎn)效率，設(shè)計開發(fā)了以枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌和植物乳桿菌為優(yōu)勢菌的復(fù)合菌劑；徐浩[11]將從高鹽辣椒坯中分離得到耐鹽酵母Yx.509 及耐鹽乳酸菌L1、L2制成混合發(fā)酵劑接種發(fā)酵剁辣椒，得到了質(zhì)脆味美的產(chǎn)品。

為了解決鹽漬辣椒汁批量使用的問題，本試驗擬將鹽漬辣椒汁作為腌制劑對新鮮紅線椒進行濕腌，擬選取在自然發(fā)酵辣醬中產(chǎn)酸量高且生長良好的植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、嗜酸乳桿菌3種乳酸菌組合而成發(fā)酵劑[12-13]，將這種乳酸菌多菌種發(fā)酵劑接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁混合后的剁辣椒中，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間3個因素，以乳酸含量為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗，對剁椒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，旨在設(shè)計出風(fēng)味優(yōu)良的產(chǎn)品，并為鹽漬辣椒汁的利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒：壇壇香4號紅線椒，湖南壇壇香食品科技有限公司；

鹽漬辣椒汁：辣椒加工企業(yè)生產(chǎn)剁辣椒過程中因鹽漬過程所產(chǎn)生的辣椒鹽坯細胞組織浸出液，湖南壇壇香食品科技有限公司；

植物乳桿菌ATCC-8014(Lactobacillusplantarum)：廣東省微生物菌種保藏中心；

腸膜明串珠菌CICC-21861(Leu-conostocmesentero-ides)：廣東省微生物菌種保藏中心；

嗜酸乳桿菌ATCC-4356(Lactobacillusacidophilus)：廣東省微生物菌種保藏中心；

MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；

氫氧化鈉、領(lǐng)苯二甲酸氫鉀、甲醛：AR級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

無水乙醇：AR級，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；

酚酞：AR級，天津市化學(xué)試劑研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AB265-S型，湖南立德測控技術(shù)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機：SS-450型，湘潭離心機配件廠；

凈化工作臺：CJ-2D型，天津市泰斯特儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPL-250型，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：WGL-230B型，天津市泰斯特儀器有限公司；

pH計：雷磁PH-S3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

雙向磁力攪拌器：78-2型，常州華普達教學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：DHG-9140A型，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

紅線椒原料挑選→清洗晾干→剁碎→加入鹽漬辣椒汁→接種發(fā)酵液→混勻裝壇→密封發(fā)酵→殺菌冷卻→成品

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將腸膜明串珠菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌3種菌株分別活化2～3代，再各吸取0.1 mL接入裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在37 ℃下擴大培養(yǎng)24 h，在3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用50 mL 0.85%的生理鹽水洗滌沉淀菌種2～3次后制成多菌種發(fā)酵劑備用(發(fā)酵種子液的菌濃度達109CFU/mL)。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

(1) 乳酸菌接種量對鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量分別為4%，5%，6%，7%，8%。在30 ℃的條件下靜置發(fā)酵5 d，發(fā)酵結(jié)束后對剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進行測定，并對產(chǎn)品進行感官評價。

(2) 發(fā)酵溫度對鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量為6%。分別在20，25，30，35，40 ℃的條件下靜置發(fā)酵5 d，發(fā)酵結(jié)束后對剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進行測定，并對產(chǎn)品進行感官評價。

(3) 發(fā)酵時間對鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種配比質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量為6%。在25 ℃的條件下分別靜置發(fā)酵3，4，5，6，7 d，發(fā)酵結(jié)束后對剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進行測定，并對產(chǎn)品進行感官評價。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計 選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間3個因素，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合原理，使用Design-Expert.8.06軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，以乳酸含量為響應(yīng)值進行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.3.5 測定指標(biāo)與方法

(1) 乳酸：酸堿滴定法，按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

(2) 氨基酸態(tài)氮：酸度計法，按GB 5009.235—2006執(zhí)行。

(3) 感官評價：感官評定采用100分制，邀請10名食品專業(yè)的研究生組成評定小組對剁辣椒的外觀、色澤、口感、風(fēng)味和形態(tài)等進行感官評分，結(jié)果取平均分作為最終評分。剁辣椒感官評分表見表1。

表1 剁辣椒感官評分表Table 1 Sensory evaluation of the chopped pepper

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用Design-Expert.8.06軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析，采用ORIGIN軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乳酸菌接種量對紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增大，乳酸和氨基酸態(tài)氮含量先增大后減小，當(dāng)乳酸菌接種量為6%時，兩者含量最大，當(dāng)乳酸菌接種量高于6%時，兩者含量又有下降趨勢。結(jié)合感官評分可以看出，乳酸菌接種量低于4%時，由于發(fā)酵劑中的乳酸菌量較少，使得發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量不高，感官評分也較低；乳酸菌接種量高于4%時，隨著乳酸菌接種量的不斷上升，辣椒風(fēng)味逐漸濃郁，當(dāng)接種量為6%時，剁辣椒感官評分最高。當(dāng)接種量超過6%后，產(chǎn)品的色澤、口感、滋味和形態(tài)都會發(fā)生一定程度的下降。以上現(xiàn)象說明隨著乳酸菌接種量的增加，紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的效果越來越好，但當(dāng)乳酸菌接種量達到一定程度后，若繼續(xù)增加，辣椒的風(fēng)味反而會適得其反，其原因在于產(chǎn)酸量是衡量一個菌種發(fā)酵能力的重要指標(biāo)，氨基酸態(tài)氮含量又是衡量剁辣椒鮮味的特性指標(biāo)[14]；當(dāng)乳酸菌接種量低于4%時，發(fā)酵液中的優(yōu)勢乳酸菌數(shù)太少，發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)主要用于乳酸菌的生長，因此，產(chǎn)酸率不高，同時由于含酸量不高，雜菌的生長和代謝未被抑制，從而破壞了剁辣椒的風(fēng)味；當(dāng)乳酸菌接種量高于6%時，乳酸產(chǎn)率逐漸降低的原因在于剁辣椒中的生物量太多導(dǎo)致菌種對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭作用[15]。所以6%的乳酸菌接種量為本試驗的最適接種量。

2.1.2 發(fā)酵溫度對紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵的重要因素，溫度過高和過低都會影響乳酸菌的代謝，從而影響產(chǎn)品的風(fēng)味。由圖2可知，20～35 ℃時乳酸與氨基酸態(tài)氮的含量不斷增加，溫度高于35 ℃時兩者略有下降。由感官評分可知，發(fā)酵溫度在20～25 ℃時，發(fā)酵辣椒風(fēng)味不足且口感不佳，因為低溫影響了乳酸菌群的生長與代謝，使得產(chǎn)酸量下降，對雜菌的抑制作用不強，導(dǎo)致發(fā)酵辣椒感官質(zhì)量不高；當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時，較高的溫度也會影響乳酸菌群的生長，使得產(chǎn)品風(fēng)味不佳。已有的研究[13]表明植物乳桿菌和腸膜明串珠菌的最適生長溫度在30～40 ℃，結(jié)合乳酸含量、氨基酸態(tài)氮含量與感官評分，選擇35 ℃為紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的最佳溫度。

圖1 不同乳酸菌接種量下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 1 Changes in various indicators ofred line chili under different lactobacillus inoculation

圖2 不同發(fā)酵溫度下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 2 Changes in various indicators of red line chili under different fermentation temperatures

2.1.3 發(fā)酵時間對紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 發(fā)酵時間是影響剁辣椒產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌不斷繁殖，發(fā)酵作用也不斷增強。由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸和氨基酸態(tài)氮含量不斷增加。發(fā)酵初期乳酸菌迅速產(chǎn)酸使得體系中pH迅速下降，有效抑制有害微生物的水平是乳酸發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)中的技術(shù)關(guān)鍵。發(fā)酵后期的乳酸含量緩慢增加的原因可能是由于酵母菌、丁酸菌等菌種分解乳酸導(dǎo)致[16]，也有可能是部分乳酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成乙酸乙酯所致[15]。由圖3還可知，發(fā)酵過程中產(chǎn)品的風(fēng)味逐漸變的濃郁，但發(fā)酵時間過長，乳酸含量過高，影響產(chǎn)品風(fēng)味，同時過度的發(fā)酵會導(dǎo)致組織軟化，從而使辣椒的脆度逐漸降低，產(chǎn)品的口感變差，其原因可能為在發(fā)酵過程中酵母菌及其他一些產(chǎn)果膠酶的菌群開始大量生長，產(chǎn)生果膠酶，使與纖維素結(jié)合的果膠物質(zhì)降解[14]。試驗結(jié)果表明，發(fā)酵至第6天時，辣椒色澤紅亮，香氣濃郁，酸度適宜，所以選擇其為最佳的發(fā)酵時間。

圖3 不同發(fā)酵溫度下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 3 Changes in various indicators of red line chili under different fermentation time

2.2 響應(yīng)面試驗

Box-Behnken試驗因素水平見表2，設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.2.1 回歸方程的方差分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到乳酸含量(Y)的回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗因素水平表Table 2 Factors and their coded levels used in Box-Behnken experimental design

表3 響應(yīng)曲面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

Y=0.74+0.025A+0.028B+0.032C-0.010AB+0.030AC-0.025BC-0.062A2-0.17B2-0.066C2。

(1)

2.2.2 交互作用分析 根據(jù)回歸方程可得到各因素之間的相互作用對剁辣椒乳酸含量影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。曲面圖可反映各因素對乳酸含量的影響程度，曲面越陡峭則影響越顯著;等高線圖越似橢圓形，表明兩因素間交互作用越顯著，將圖4中(a)、(b)、(c)3圖進行對比后得知，接種量與發(fā)酵溫度之間的交互作用最為顯著。

2.2.3 紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵工藝的優(yōu)化組合及驗證 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為乳酸菌接種量6.27%、發(fā)酵溫度35.26 ℃、發(fā)酵時間6.30 d，預(yù)測在此工藝條件下，產(chǎn)品乳酸含量值為0.747%。為了實際操作時的便利設(shè)計驗證實驗的優(yōu)化條件為乳酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間6 d，經(jīng)3次平行實驗后得到產(chǎn)品乳酸含量為0.74%，且風(fēng)味良好，與理論預(yù)期值基本相符。

表4 回歸模型的方差分析?Table 4 Analysis of variance of regression model

? **.差異極顯著，P<0.01；*.差異顯著，P<0.05。

圖4 各因素交互作用對剁辣椒乳酸含量的影響Figure 4 The effects of various factors on the lactic acid content of chopped pepper

3 結(jié)論

本試驗采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和腸膜明串珠菌3種乳酸菌組成的多菌種發(fā)酵劑對使用鹽漬辣椒汁作為腌制劑的紅線椒進行接種發(fā)酵，發(fā)酵后得到風(fēng)味良好的產(chǎn)品。同時得到最佳的工藝條件組合為乳酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時間6 d，經(jīng)驗證實驗后得到乳酸含量為0.74%，且風(fēng)味良好的產(chǎn)品。

回顧試驗過程對鹽漬辣椒汁與紅線椒發(fā)酵產(chǎn)品的進一步研究提出以下展望：

(1) 剁辣椒發(fā)酵過程中以乳酸菌為主的益生微生物發(fā)揮著重要的作用，除乳酸菌外的酵母菌、醋酸桿菌、丁酸菌等微生物的生長繁殖對發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)有一定的影響，本次試驗多菌種發(fā)酵劑中的3種菌株皆屬乳酸菌類，下一步可對其他菌種發(fā)酵劑的配方進行研究，進一步提高產(chǎn)品品質(zhì)。

(2) 在鹽漬辣椒汁的研究上，參數(shù)、指標(biāo)的選取仍是一個關(guān)鍵問題，下一步研究可對產(chǎn)品中有機酸含量與組成、氨基酸組成、揮發(fā)性成分等指標(biāo)進行監(jiān)測，更為全面地對產(chǎn)品品質(zhì)進行把關(guān)。

(3) 將鹽漬辣椒汁作為腌制劑發(fā)酵紅線椒，產(chǎn)品脆度稍差，可考慮添加鈣鹽類保脆劑提高產(chǎn)品的脆度。

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