我國嗜尸性蠅類分子鑒定的研究現(xiàn)狀與分析

趙琳琳，翟仙敦，鄭 哲，李永林，莫耀南

（河南科技大學 法醫(yī)學院，河南 洛陽 471003）

死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷 是法醫(yī)學研究的熱點和難點。昆蟲學方法經(jīng)過科研工作者的不斷研究和基層法醫(yī)的實踐，被認為是推斷死亡時間的一種有效方法。法醫(yī)昆蟲學的研究對象是與尸體有關的昆蟲，即嗜尸性昆蟲，其中與尸體關系最為密切的是鞘翅目和雙翅目昆蟲。雙翅目中的麗蠅科、麻蠅科、蚤蠅科、花蠅科、蠅科，以及鞘翅目中的埋葬甲科、隱翅蟲科、皮蠹科與郭公甲科最為重要。相對于嗅覺靈敏且能長途飛行的蠅類，甲蟲通常侵襲尸體稍晚。并且嗜尸性甲蟲全球性甚至全國性分布的種屬較少，僅有大隱翅蟲（Creophilus maxillosus）、白腹皮蠹（Dermestes maculatus）、鉤紋皮蠹（Dermestes ater）以及赤足腐郭公（Neccrobiarufipes）等少數(shù)幾種[1]。 因此，相比較而言，雙翅目中的蠅類是研究和實際應用最多的類型。

1 嗜尸性蠅類用于推斷PMI的瓶頸

利用昆蟲學知識進行法醫(yī)學死亡時間推斷，最關鍵是要對嗜尸性蠅類種屬做出準確鑒定。但在尸體及其附近發(fā)現(xiàn)的各發(fā)育階段的蠅類，僅用形態(tài)學方法鑒定其種屬往往比較困難。究其原因[2]：首先昆蟲種類繁多，并且包含許多形態(tài)特征極其相近的近似種、近緣種以及種以下的亞種、生物型和地理種群，僅有少數(shù)形態(tài)學家能對其熟悉科目的種類進行物種鑒定；其二，蠅類卵、幼蟲等形態(tài)差異較小，鑒別極難，如帶回實驗室飼養(yǎng)到具有足夠形態(tài)特征來鑒別的成蟲，將耗費大量的時間而影響案件的偵破，并且還要承擔孵化失敗的風險；其三，很多情況下案發(fā)現(xiàn)場只能采集到形態(tài)不完整的成蟲、蛹殼，形態(tài)特征缺失，使形態(tài)學鑒定更加困難。嗜尸性蠅類的推廣應用存在著許多障礙，嚴重降低了嗜尸性蠅類在實際案例應用中的價值，很大程度上阻滯了法醫(yī)昆蟲學的發(fā)展。因此，廣大法醫(yī)科研工作者都在努力尋找新的方法解決這一難題。

2 分子生物學鑒定

分子生物學的快速發(fā)展給嗜尸性蠅類的種屬鑒定提供了新的契機，近20年世界范圍的相關研究一直呈現(xiàn)上升趨勢（圖1），它能夠在基因水平上對物種進行快速有效的鑒別，同時還可以探討昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育學特點。由于生物DNA不受發(fā)育階段的影響，終生不變，并且分子生物學方法對樣本保存條件要求較低，單個翅膀或足就能提取到足夠的DNA。鑒于以上特點嗜尸性蠅類的分子鑒定成為其形態(tài)學鑒定的重要方法補充。科研工作者采用多種方法對多個地區(qū)和蠅種進行了廣泛而深入的研究。

2.1 DNA序列分析是分子鑒定的主要方法

嗜尸性蠅類分子鑒定所用的方法主要有：限制性內切酶片段長度多態(tài)性（Restriction FragmentLength Polymorphism，RFLP）、擴增片段長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，ALFP）、隨機擴增多態(tài)性DNA標記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、簡單重復序列多態(tài)性（Inter-simple SequenceRepeat， ISSR）、序列特意擴增區(qū)域（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR）以及 DNA 序列分析（DNA sequence analysis）等[3]。 但由于方法本身的限制，如RFLP由于受酶切位點的限制、RAPD受遺傳方式和引物的限制、ALFP引物需要使用同位素和非同位素標記等，目前應用最多的是DNA序列分析，與其他方法相比更加直觀，唯一的缺點就是測序成本較高，但隨著測序技術的普及和新一代測序（next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展，這一方法必將得到廣泛應用。

圖1 近20年世界范圍嗜尸性蠅類（A）及其分子鑒定（B）研究趨勢

我國學者采用該方法進行了許多研究，劉欽來[2]、蔡繼峰[4]、應斌武[5]、白鵬[6]、陳鳳磊等[7]、李進華等[8]、王興華[9]、郭亞東[10]、湯振楚等[11]、熊楓[12]、Sanaa等[13]對全國多個地區(qū)的蠅科、麗蠅科、麻蠅科等的多個蠅種，王江峰等[14]、楊靜波等[15]對廣東、河南、四川、陜西的蠅科和麗蠅科9個蠅種，陳慶等[16]對北京的7個優(yōu)勢蠅種，法娜[17]對浙江華家池麗蠅科的7個蠅種，張紅玲等[18-19]對貴陽麗蠅科、麻蠅科、蠅科、花蠅科4科11屬19個蠅種，王劍峰等[20]對遼寧省、廣東省的蚤蠅科的4個蠅種，李學博等[21]對重慶麗蠅科、麻蠅科的7個蠅種，吳榮全等[22]對福建省麗蠅科、麻蠅科、花蠅科、蠅科的15個蠅種，趙琳琳等[23]，趙祖亮[24]對河南洛陽、鄭州地區(qū)蠅科、麗蠅科、麻蠅科的多個蠅種進行了研究。所采用的分子標記所在的基因有：線粒體基因組的COI，COII，16S rRNA，CYTB，ND1，ND5 基因和核基因組的 ITS1，ITS2 基因，分子標記信息見表1。但不同學者所采用的分子標記在基因上的位置有所不同。

2.2 我國嗜尸性蠅類分子鑒定地區(qū)和蠅種統(tǒng)計

根據(jù)國內嗜尸性蠅類分子鑒定研究和記錄進行統(tǒng)計，共有29個省（包括省、自治區(qū)、直轄市、不包括香港和澳門），包含麗蠅科（19個），蠅科（10個），麻蠅科（12 個），花蠅科（1 個），蚤蠅科（4 個）共46個蠅種。總體來說，南方地區(qū)研究較北方多，而絲光綠蠅、大頭金蠅和棕尾別麻蠅被多地區(qū)分子鑒定研究，具體結果見圖2。

圖2 我國嗜尸性蠅類分子鑒定地區(qū)和蠅種統(tǒng)計

3 研究現(xiàn)狀及分析

我國地域遼闊，經(jīng)緯跨度大，氣候類型多樣，很多地區(qū)（王江峰，珠江三角洲[35]；陳祿仕，貴州[36]；李玲，哈爾濱[37]；馬玉堃，杭州等）已經(jīng)在嗜尸性蠅類的生長發(fā)育和群落演替規(guī)律方面開展了較多研究，但由于地理位置、環(huán)境溫度、營養(yǎng)狀況等自然條件對蠅類的卵、幼蟲、蛹的發(fā)育的影響較大，并且蠅類種類繁多，不同蠅種間的卵、幼蟲、蛹形態(tài)差異很小，還存在一些形態(tài)特征極其相近的近似種、近緣種以及種以下的亞種、生物型和地理種群，有時同一蠅種的不同地理種群間也存在明顯差異，這些都對明確蠅類發(fā)育資料和形態(tài)學分類帶來困難。另外各實驗室均是單獨研究，沒有相對統(tǒng)一的科學標準，研究結果的科學性難以保證。盡管我國學者已經(jīng)用分子生物學方法針對蠅類的種屬鑒定展開了較多研究，但所采用的分子標記多不相同，即使所在基因相同，在基因上的位置（包括長度）也不相同（表1），并且大多是針對單一地區(qū)的某幾個蠅種的幾只樣本，沒有在全國范圍內統(tǒng)一進行。

表1 我國用于嗜尸性蠅類分子鑒定的分子標記

很多學者針對不同長度分子標記進行過研究，如COI+COII全序列或線粒體全基因組分析，但序列長度過長，對提取的DNA質量要求較高，蠅類樣本保存條件亦是，同時需要多對引物擴增，測序結果需要拼接，容易產生錯誤，并且成本較高、對實驗人員要求嚴格，不利于推廣。陳慶等[16]采用COI中1120bp基因序列對北京地區(qū)紅頭麗蠅、大頭金蠅、絲光綠蠅、肥須亞麻蠅、急鉤亞麻蠅、棕尾別麻蠅、家蠅共7個優(yōu)勢蠅種進行分子鑒定，并且用與蔡繼峰[4]COI基因278bp序列中重合的186bp序列構建UPGMA系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了相同的分支模式。但在使用全序列或部分序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，同一物種個體序列聚集的同時也有部分物種整體出現(xiàn)在和分類學結果不一致的位置。劉欽來[2]采用272bp和278bp COI片段成功鑒定了70多只嗜尸性麗蠅，其中包括一些難以區(qū)分的姐妹物種，如絲光綠蠅和銅綠蠅，亮綠蠅和叉葉綠蠅等，種類鑒別能力值得肯定，但這兩個片段在NJ系統(tǒng)進化樹上對于屬以上高階元的分類系統(tǒng)與形態(tài)學結果有一定出入。這可能與短片段序列所含信息太少有關。關于哪個或哪些基因的哪個片段包含足夠的信息用于蠅類的分子鑒定，尚需要進一步的研究和實踐。

此外，根據(jù)Wells等[25]學者的研究表明，判定一個遺傳標記是否能夠進行嗜尸性蠅類的分子鑒定，起決定作用的是種內序列變異的百分比，且與種間序列變異百分比無重疊。聯(lián)合線粒體基因COI+II進行鑒定，種內差異＜1%，種間差異≥3%，通過分子鑒定，即使不能夠準確確定某一特定嗜尸性蠅種，至少可以把未知蠅種定位于某一特定的進化分支上。因此判斷樣本是否同種標準不應該局限在種內差異＜1%，種間差異≥3%，而應是蠅種是否位于某一特定的進化分支上，并且種內種間變異百分比無重疊。

4 展望

應用嗜尸性蠅類推斷PMI是法醫(yī)學的重要手段，全國范圍內沒有統(tǒng)一的嗜尸性蠅類生長發(fā)育和群落演替規(guī)律可循，所以每個地區(qū)都有必要開展獨立研究，并建立當?shù)厥仁韵夘惿L發(fā)育和群落演替數(shù)據(jù)庫，與此同時開展全國各地區(qū)嗜尸性蠅類種屬的分子鑒定研究，建立分子鑒定數(shù)據(jù)庫。但以上各項也必須統(tǒng)一進行，建立國家標準以保證研究結果的科學性和實用性。此外對于近緣種的判定還需要更多遺傳標記的開發(fā)和聯(lián)合應用。

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