AIT生物包裝調控藍莓貨架品質及抗氧化活性研究

吳 韜，袁 旭，王慶慧，李明元，吳勝勇，伍小宇，李偉麗,2,3*

(1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039; 2.天津科技大學食品營養與安全重點實驗室，天津 300457;3.天津捷盛東輝保鮮科技有限公司，天津 300300)

近年來，食品貨架保鮮包裝逐漸趨向于來源天然、抗菌防腐、環境友好型的綠色產品。前期研究[1]證實，將農業加工副產物甜菜皮渣與生物原料聚乳酸經熱塑加工可得到熱塑性膜基材(PLA/TSBP)。高纖維熱塑粒子降低聚乳酸玻璃態轉變溫度，改善其單一聚乳酸膜的柔韌性能，生物膜基材PLA/TSBP可滿足食品包裝對機械性能和熱化學性能的要求，作為保鮮基材使用。

異硫氰酸烯丙酯(ally isothiocyanate, AIT)提自十字花科植物，是硫葡萄糖苷酶和黑芥子硫苷酸鉀水解產物。研究[2-3]報道，AIT熏蒸處理顯著抑制梨果青霉菌，但因AIT的強刺激性和揮發性，直接使用往往對果皮組織造成不可逆轉的傷害。理想途徑是將AIT通過吸附載體作為抑菌涂層引入保鮮包裝材料表面或與其內部分子結合，達到緩釋效果，實現較長期抑菌保鮮功效[1-3]。AIT精油的載體廣泛集中于多糖和多肽類化合物如玉米淀粉、大豆蛋白、殼聚糖等。研究[1]表明，AIT/殼聚糖涂層的聚乳酸-甜菜皮渣(PLA/TSBP)生物保鮮膜在液體培養基中對李斯特菌和沙門氏菌等病原性致病菌具有較強的抑制作用，但是對于鮮活果實貨架期保鮮品質和抗氧化研究鮮見報道。

藍莓果質溫和細膩，富含對人體有益的花色苷、黃酮等生物活性成分，被譽為“漿果之王”，是國際糧農組織推薦的人類5大健康食品之一[10]。但藍莓貯藏周期極短，常溫僅5～7 d，因其皮嫩多汁，貨架期極易受真菌危害、腐爛劣變、品質下降、生物活性銳減，嚴重限制了藍莓產業發展。本試驗旨在利用具有AIT/殼聚糖抑菌涂層的新型可降解生物膜PLA/TSBP，結合藍莓貨架保鮮緩釋模擬設備，考察此生物膜作為生鮮食品包裝對藍莓貨架期生物品質的調控作用，為環保型生物膜的發展及保鮮包裝模式提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 活性包裝抑制藍莓真菌試驗

1.1.1 菌種制備

青霉菌和灰霉菌從腐爛的藍莓果實經過分離純化獲得。2種真菌保存在-20 ℃馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。活化時，用接種環挑取菌絲培養于馬鈴薯葡萄糖液體培養基，室溫振蕩24 h。菌種孢子懸浮液經高速離心機10 000 r/min離心10 min。去除上清液，沉淀經30 mL 的0.1%蛋白胨水制備成懸浮液，使最終孢子數量達到104CFU/mL。

1.1.2 抑菌試驗

1.1.2.1 生物保鮮膜制備

試驗用生物膜制備參照文獻[1]，簡要制備流程為：甜菜皮渣、甘油和水以質量比5 ∶1 ∶1不斷混合至均勻，室溫密封8 h。利用同步旋轉雙螺桿擠出機(Leistritz ZSE-18，美國)將甜菜皮-甘油混合物熔融擠出制得具有熱塑性的甜菜皮(TSBP)。將聚乳酸/TSBP混合料(50/50；m/m)混勻，加入同型雙螺旋擠出機熔融共擠得到生物膜基材。將載體殼聚糖和生物抑菌因子AIT(純度>98%，美國Sigma公司)以1 ∶1(mg/mL)加入體積分數為1%的乙酸溶液混勻制備活性抑菌涂層，通過涂布和高壓壓膜將其固定于基材表面，制備好的包裝膜AIT面密度為8.16 μL/cm2。活性生物膜(以下簡稱AIT包裝)如圖1所示。

圖1 AIT涂層生物包裝緩釋保鮮裝置

1.1.2.2 模擬緩釋保鮮裝置

挑選同批次色澤、大小一致的新鮮健康藍莓果(超市自購)浸泡于0.1%次氯酸鈉溶液中，2 min撈出，單層平鋪在通風櫥中晾30 min。將藍莓果浸泡在1.1.1中真菌懸濁液3 min，取出自然放置至表面無多余水分。取浸泡接種真菌藍莓，16個為1組擺放在無菌玻璃平板(4 cm×8 cm)上，將此平板放入平放的體積為1 L無菌玻璃罐內；用雙面膠固定AIT活性包裝(2×8 cm，初始AIT面密度8.16 μL/cm2)在玻璃罐內壁，有抑菌層的一面向外(如圖1)。

AIT浸漬濾紙處理組(以下簡稱AIT精油)：取包裝膜同等尺寸濾紙，將精油和乙醇以體積比為1 ∶1溶液浸入濾紙，使其充分吸收的AIT與活性包裝AIT面密度一致。 將AIT濾紙快速固定在玻璃內壁，玻璃罐內放相同菌液處理的藍莓，與AIT生物包裝做對比。將玻璃罐密封，罐蓋頂部鉆有小孔，用塑膠圈密封，以方便試驗期間檢測頂空AIT面密度。

以空白玻璃罐處理樣品對空白對照。所有試驗處理組重復3次，每次3組平行，取平均值計算。

1.1.2.3 藍莓真菌抑制效果測試

樣品玻璃罐置于室溫，24 h后將玻璃罐打開取出樣品，放入組織均質袋中并加入與藍莓同等質量的0.2%蛋白胨水均質2 min，用蛋白胨水對均質袋過濾后的濾液進行梯度稀釋。經過青霉菌和灰霉菌感染的藍莓果肉組織濾液梯度稀釋，分別取100 μL涂布在馬鈴薯葡萄糖培養基(含50 mg/L的鏈霉素)，室溫培養生長3 d，收集青霉和灰霉菌的分生孢子，在無菌水中進行梯度稀釋，通過8層過濾紗布，調整菌懸液最后濃度為104個/mL。用普通光學顯微鏡輔助以DigitCamera顯微攝像鏡頭和血球計數板測量，統計每組平行實驗病原菌抱子萌發率和芽管伸長度。每組實驗觀察50個孢子，試驗重復3次。

1.2 藍莓貨架期品質測定

1.2.1 果實腐爛率

藍莓表面出現腐爛霉點的果實視為腐爛果。腐爛率=(腐爛果/果實總數)×100%。

1.2.2 果實硬度

使用TA-XT2i質構儀測定，采用直徑為3 mm探針穿透果實赤道線中部10 mm，速率為10 mm/s。每組試驗測定5次，重復3次。采用Texture Expert version 1.22軟件處理數據，選取測量最大值表示藍莓硬度。

1.2.3 果實糖類和有機酸含量

藍莓果肉樣品4 g加入20 mL咪唑緩沖液(20 mmol/L，pH7.0)均質混合。化合物提取、純化、和水解方法參照Wang等[12]方法。糖類和有機酸的分離采用安捷倫6890N GC高效氣相色譜儀分析測試，儀器配有離子火焰檢測器和彈性石英毛細管柱(12 m×0.2 mm)。本文用樣品出峰與對照品峰面積之比計算各物質的相對含量。

1.3 藍莓生物活性含量測定

1.3.1 藍莓樣品前處理方法

取16個未經任何處理的藍莓放入玻璃平板上，罐內壁固定AIT生物包裝膜或固定AIT濾紙片或無任何處理。24 h后打開玻璃罐取出藍莓，16個果實為1組放入塑料盒中(2.0 cm×15 cm×10 cm)，在4 ℃下貯存15 d，定期取出藍莓果實進行生物活性物質測定。每組試驗平行重復3次，每次3組平行。

將各組樣品的藍莓果實用液氮研磨，冷凍干燥至恒重。取5.0 g凍干粉末樣品，加入25 mL 乙酸甲醇提取液(V甲醇∶V水∶V乙酸=80 ∶19 ∶1)，置于錐形瓶中，超聲提取10 min，5 000 r/min離心15 min。上清液經0.45 μm 濾膜過濾，提取液保存在-80 ℃冰箱中備用。提取液用于總黃酮含量、總酚、總花青素含量以及抗氧化能力等檢測。

1.3.2 總黃酮含量

總黃酮含量采用比色法測定[6]。以蒸餾水作為空白對照，在波長520 nm處讀取吸光度值。結果表示每克干物質含有兒茶素當量的毫克量，mg catechin equivalent (CE)/g 干物質(DW)。

1.3.3 總酚含量

總酚含量(total phenolic content，TPC)采用斐林試劑法測定[5]。利用紫外-可見全光譜酶標儀測定波長765 nm的吸光度值，以甲醇溶液作為空白對照，以質量濃度為20～100 μg/mL的沒食子酸做標準曲線，計算總酚含量，表示為每克干重中沒食子酸當量的毫克量，即mg gallic acid equivalent (GAE) / 100 g (DW)。

1.3.4 花青素含量測定

果實花青素含量參照Wolfe等的方法[7]。利用pH差異法：樣品分別溶于pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液，測得各自在510 nm和700 nm下的吸光值。吸光值用摩爾消減系數26 900和吸光值A=[(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5 ]轉化為矢車菊素-3-葡萄糖苷毫克數。總花青素含量表示為：mg 轉化為矢車菊素-3-葡萄糖苷/100g DW。

1.3.5 總抗氧化能力測定

本文以2，2-Di (4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl (DPPH) 分析方法測定藍莓果實的總抗氧化能力(參照文獻中方法[8])。5 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液與10 mL的藍莓果實提取液/甲醇混合。溶液室溫下避光保存30 min，測得517 nm下吸光值減少量。對照組用甲醇代替甲醇提取物，空白組用甲醇代替DPPH溶液。

1.4 數據統計

采用SPSS 16.0 軟件對數據進行整理統計分析，各項指標結果以“平均數(n=3)±標準誤差”表示，Duncan氏多重比較差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理方法對藍莓真菌抑制效果的影響

表1為3種不同處理方法(AIT包裝、AIT精油、對照)對藍莓真菌抑制效果。如表1所示，AIT包裝和AIT精油均抑制青霉和灰霉菌孢子的生長。室溫下培養3 d，對照組青霉發芽率為96%，芽管長度為98 μm，而AIT精油和AIT包裝組的發芽率分別僅為5%和15%，兩種樣品均顯著低于對照。AIT精油組青霉菌芽管長度是AIT包裝組的1/15。抑制效果顯著優于后者。灰霉菌的發芽率在3組果實中分別為92%(對照)、10%(AIT精油)和26%(AIT包裝)，三者芽管長度分別為93、15和65 μm。結果表明：AIT精油組對青霉和灰霉孢子繁殖抑制效果最佳；AIT包裝膜通過緩釋也達到了控制青霉和灰霉繁殖擴散的目的。

表1 不同處理方法對藍莓青霉菌和灰霉菌孢子發芽率和芽管長度的影響

藍莓果實表皮層稀薄軟嫩，自帶真菌孢子，采后預處理環節不及時，極易受到真菌的侵染，導致果實快速腐爛。青霉菌和灰霉菌是引起藍莓腐爛最嚴重的致病真菌。研究表明，AIT具有廣譜抑菌殺菌的能力，對果蔬真菌的控制起到積極的作用。Chanjirakul等[16]報道AIT熏蒸處理降低了草莓、樹莓、黑莓等漿果的腐爛劣變程度，最小抑菌質量濃度分別為細菌34～110 ng/mL，酵母菌16～37 ng/mL，霉菌16 ～ 62 ng/mL。研究報道真菌所需最小AIT抑菌質量濃度為3.8～118 μg/mL。說明同一屬的腐爛菌存在最小抑菌濃度差異[11]。本研究中AIT包裝膜和AIT精油處理時初始面密度約為8.16 μL/cm2，兩者對青霉菌抑制效果均優于灰霉菌。在貨架期前3 d，不論是青霉還是灰霉菌，AIT精油都顯著高于AIT包裝效果，可能是活性包裝中的抗菌因子AIT通過殼聚糖結合嵌入生物膜表面，達到緩慢釋放、長效抑菌效果。

2.2 不同處理貨架期果實品質

2.2.1 果實腐爛率

如圖2所示，AIT包裝和AIT精油處理顯著抑制了冷藏藍莓腐爛率。對照果實在第3天檢出少量的腐爛果。AIT包裝組在第6天發現腐爛果； AIT精油組在9 d內未發現果實腐爛。貯藏15 d，對照組果實腐爛率高達20%，AIT包裝組腐爛率低于8%；AIT精油組藍莓腐爛率僅4%，顯著低于對照。藍莓表面自帶的腐爛菌數量一般低于104CFU/g，低濃度的AIT處理對果實表面微生物的繁殖起到顯著抑制作用，利于后期貯藏加工。AIT被果皮表層細胞吸附，減少菌群擴張，但貯藏時間延長，有效成分損失殆盡，菌落復蘇滋長，開始腐爛變質[12];因此，根據貯藏規模應及時調整AIT處理濃度和時間。

(□.空白對照；△.AIT包裝；◇.AIT精油)

2.2.2 果實硬度、有機酸和糖類含量變化情況

如表2所示，AIT精油處理的藍莓較對照果硬度顯著降低，貨架期結束，AIT精油組樣品硬度較AIT活性包裝組降低50%，果實松軟、渙散。AIT包裝處理對藍莓硬度保持較好，在4 ℃貨架期15 d為0.84 kg，較對照提高近1.5倍。研究[16-18]顯示，精油不僅能夠抑制多種細菌和霉菌，且含有多種酚類基團，能夠提供抗氧化和清除自由基的因素，推遲果實氧化物質積累，維持果實硬度和光亮外表。

表2 不同處理方法對藍莓果實硬度、有機酸和糖類含量的影響(4 ℃貯藏15 d)

由表2可知，檸檬酸是藍莓果實含量最高的有機酸，為蘋果酸的10倍之多。冷藏貨架期間，2種酸的含量逐漸降低。其中蘋果酸的降低幅度較明顯，最多高達50%。AIT包裝可夠延緩2種有機酸的減少速度。AIT精油組有機酸含量損失較多，貯藏末期檸檬酸和蘋果酸的含量均為對照的一半。AIT生物膜釋放處理與對照的有機酸含量無顯著差異。藍莓果實主要糖類物質有3種，蔗糖、果糖和葡萄糖。果糖和葡萄糖所占比重較為接近，約為蔗糖含量的100倍以上。藍莓處理后糖類物質略有減少，但降低程度很小。4 ℃貯藏15 d，與對照相比，AIT包裝增加了蔗糖成分，對果糖和葡萄糖影響不大。AIT精油處理在貯藏前10 d糖類成分比較穩定，并且果糖成分維持較高，蔗糖和葡萄糖的含量只有對照的50%左右。

2.2.3 生物活性變化情況

藍莓冷藏貨架期間總黃酮含量如圖3所示。AIT包裝處理較好地維持了果實總黃酮含量，與對照相比略有減少。AIT精油處理藍莓總黃酮水平損失最大，最低值僅2 mg CE/g DW，低于對照50%。原因可能是高濃度AIT對果實黃酮類物質代謝產生了負面效應，降低了生物活性物質的積累速度。漿果采后初期原花色苷和黃烷醇類生成積累，黃烷醇是果實成熟初期主要酚類物質，隨著貯藏期延長含量降低，花色苷大量積累[13]。藍莓花青素水平的升高與果實成熟后酚類與黃酮類水平降低相關。總黃酮含量在藍莓果實貯藏過程中顯著下降(P<0.05)。

圖3 不同處理方法對4 ℃下貯藏15 d藍莓總黃酮含量的影響

如圖4所示，藍莓在貯藏前期總酚水平呈下降趨勢，第10天含量增加，貯藏后期水平降低。與總黃酮類似，AIT生物膜有利于維持總酚物質的積累，但AIT精油處理破壞了果實酚類物質的代謝，影響了果實抗氧化體系的代謝功能。

圖 4 不同處理方法對4 ℃下貯藏15 d藍莓總酚含量的影響

如圖5所示，藍莓果實在4 ℃貯藏15 d總花青素含量在第5天增加，之后維持平穩水平。AIT包裝與對照果實比無顯著差異(P>0.05)。AIT精油處理的藍莓果實花青素水平顯著降低(P<0.05)，低于對照的1/3。藍莓果實花青素在轉色初期開始積累，含量不斷上升。研究[14-16]表明，藍莓和蔓越橘藍莓在貯藏過程中總花青素含量和總酚水平會出現增加。小果形類果實如草莓、樹莓和藍莓等在0 ℃以上貯藏，經常出現生物活性成分(總黃酮、花色素、酚類)和抗氧化能力提高的現象。表明藍莓采后繼續合成了花青素和其他酚類物質。可溶性糖和有機酸的消耗可能為酚類物質合成提供了碳骨架。這些生物活性成分與果實總抗氧化能力密切相關。

圖5 不同處理方法對4 ℃下貯藏15 d藍莓總花青素含量的影響

2.1.4 藍莓果實總抗氧化能力變化情況

如圖6所示，藍莓果實4 ℃貯藏15 d DPPH不斷下降。對照DPPH初始約為98 %，貨架期結束含量降低了60%。AIT包裝和AIT精油組果實成熟過程中DPPH顯著下降，15 d分別達到30%和25 %，與對照比較，均有一定程度減少。花青素含量高的果實抗氧化能力最高峰出現在轉色期。果實抗氧化能力與高抗氧化能力的咖啡酸等相關[19-20]。

圖6 不同處理方法對4 ℃下貯藏15 d藍莓DPPH的影響

3 結論

本實驗采用AIT涂層的聚乳酸/甜菜皮渣(PLA/TSBP)生物可降解包裝膜，對藍莓進行冷藏貨架期保鮮研究。該生物包裝膜可有效降低藍莓真菌侵染，抑制青霉菌和灰霉菌等引發藍莓果實腐爛的真菌病害擴展，進而降低果實腐爛率和延緩果實軟化速度。與AIT精油處理對比，它能更有效維持藍莓風味成分和營養物質，遏制果實中黃酮、多酚、花青素等生物活性組分的損失，保持了藍莓貨架期的優良品質。

參 考 文 獻

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