氰化物污染土壤微生物修復方法初步研究

房彬 ，張建 ，薛二軍 ，王連杰 ，劉建闊 ， 張慧

（1.天津大學環境科學與工程學院，天津300350；

2.天津創業環保集團股份有限公司，天津300381；3.山東創業環保科技發展有限公司，山東臨沂276400）

伴隨氰化物大規模應用而來的土壤氰化物污染問題，已成為當今重大社會關切。氰化物在土壤中自然降解速率大大慢于天然水體中的降解速率，超過土壤凈化能力的氰化物在土壤中殘留、蓄積和運移，成為環境的二次污染源，對水體、糧食生產及人類健康長期存在潛在危害，迫切需要修復治理。當前,對含氰廢水的化學和生物方法處理已多有報道[1]，含氰土壤的修復方法主要有植物修復和化學修復[2，3]，而利用微生物手段修復氰化物污染土壤卻鮮有報道。研究通過為氰化物污染土壤生物修復篩選菌種資源，評估修復效果，嘗試為氰化物修復提供了經濟有效的新思路，為優化氰化物污染微生物修復工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 氰化物污染土壤室內修復試驗

供試土壤取自天津港某?；穫}庫周邊,取樣深度為0～30 cm,把采集來的土樣盡快混勻，避光風干，去除雜質，粉碎，研磨到全部過孔徑18目篩。設置添加菌劑的修復處理和相應不添加菌劑的對照處理：修復處理加入氰化物污染土壤樣品200 g，10%的比例接種混合降解菌，使用移液槍移取高純水至土壤含水量達到20%，攪拌均勻，稱重以便后期補水。對照處理不接種降解菌，含水量同樣調節至20%。將裝有污染土壤的培養燒杯在25℃人工氣候箱內持續培養，根據失水量，每1 d補水并攪拌一次。

1.2 總氰化物測定

氰化物含量分析采用新鮮土樣，分光光度法測定[4]。

1.3 氰化物降解菌群馴化，鑒定及菌液配置

本研究組前期從鐵藍涂料的生產廢水中篩選馴化得到高效降氰菌群，具體步驟包括廢水水樣稀釋；涂布法分離純化耐氰菌種；不同濃度KCN培養基馴化耐氰細菌。根據形態特征和生理生化特點，利用分子生物技術分析其群落結構。根據試驗用接種量將選擇優化出的菌群進行放大培養，配制成菌液制劑。

2 結果與討論

2.1 菌群對氰化物降解作用研究

將菌懸液按10%量接種到氰化物污染土壤，在試驗的 0，1，2，3，8 d 分別在試驗組和對照組取土壤測試。最初接種24 h內，降氰菌發揮降氰作用較為迅速，延滯期較短，氰化物降解率達到26.9%，之后降解率增加緩慢，并趨于穩定，第8 d累計降解率為33.3%（表1，圖1）。生物修復效果取決于生理和代謝中有能力在受污染環境中降解污染物微生物的存在；一方面，營養物質對本研究降氰菌的生物降解產生了影響，另一方面，降氰菌群在培養條件下失去了競爭優勢也是可能的原因。而對照區反映了沒有添加任何物質土壤中氰化物含量變化，累計去除率在4%左右，說明在自然條件下土壤中氰化物降解是緩慢的，這和李社紅等人[5]的研究結論相符。

表1 不同處理土壤氰化物質量分數隨時間變化 mg/kg

圖1 不同處理土壤氰化物降解率隨時間變化

2.2 降氰菌的篩選、馴化及生物學分類地位的確定

為進一步提升菌群對氰化物的去除效果，利用分子生物技術分析其群落結構。結果表明，該菌群包括2種酵母菌（圖2a）和8種細菌（圖2b），其中細菌為水谷鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium mizutaii）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、惡 臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、產酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、產堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）、類桿菌屬（Bacteroides sp.）和沙雷氏菌屬（Serratia sp.）。Sphingobacterium mizutaii所占比例最高，達 61%，為該菌群的優勢菌種。另外，菌種Ochrobactrum sp.，Pseudomonas putida和Klebsiella oxytoca在菌群中所占比例為8%～10%，屬于污水生物處理過程的中常見菌株，能夠降解包括喹啉在內的多種芳香烴化合物。Alcaligenes sp.，Achromobacter sp.，Bacteroides sp. 和Serratia sp.在菌群中所占比例較低，僅為2%～3%，其中菌Alcaligenes sp.據報道可分泌中降氰酶[6]，能夠將氰化物降解為NH3，而Bacteroides sp.和Serratia sp.對鉻、錳等重金屬離子具有較強的耐受能力。此外該菌群中還包含兩種真核生物酵母菌，其中毛孢子菌屬（Trichosporon）在含氰廢水處理過程有過相關的應用報道[7]。

圖2 氰降解菌群群落結構組成

3 結論

試驗對鐵藍涂料的生產過程含氰廢水進行菌群分離、馴化，最終確定細菌類的水谷鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium mizutaii）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和真菌類的毛孢子菌屬（Trichosporon）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）等菌群。對這些菌群進行放大培養，進行氰化物污染土壤修復試驗研究。經過8 d微生物修復試驗，土壤中的氰化物累計降解率達到33.3%，而對照區土壤中人為添加的氰化物含量變化不大，累計去除率在4%左右，說明在自然條件下土壤中氰化物降解是緩慢的。開展對土壤溫度、水分、氧和營養物質等環境因素的調控作用研究，提高土壤氰化物降氰效率，是今后研究工作開展的重點。

[1] 張建，王萬超，李玉慶，等.工業廢水中氰化物的生物去除技術研究進展[J].安徽農業科學，2015，43(17):275-278.

[2] Kang D-H，Hong L Y，Schwab A P，et al.Removal of Prussian blue from contaminated soilin the rhizosphere of cyanogenic plants[J].Chemosphere，2007，69(9):1 492-1 498.

[3] 于曉章.氰化物污染的植物修復可行性研究[J].生態科學，2004，23(2):97-100.

[4]國家環境保護部.土壤氰化物和總氰化物的測定分光光度法：HJ745-2015[S].北京:中國環境科學出版社，2015.

[5] 李社紅，鄭寶山，朱建明，等.金礦尾礦渣及其污染土壤中氰化物的分布及自然降解[J].環境科學，2001，22(3):126-128.

[6]Dubey S，Holmes D.Biological cyanide destruction mediated by microorganisms[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，1995，11(3):257-265.

[7] 秦勝東，郭嘉 ，劉玉存，等.固定化微生物技術研究進展及其在水處理中的應用[J].水處理技術，2014(10):003.