多元抗生素與重金屬混合物對蛋白核小球藻的時間依賴性協同與拮抗作用

陳 敏 ，張 瑾 ，2，3*，董欣琪 ，班龍科 ，卞志強

（1.安徽建筑大學環境與能源工程學院，安徽省水污染控制與廢水資源化重點實驗室，合肥 230601；2.安徽建筑大學安徽省綠色建筑先進技術研究院，合肥 230601；3.清華大學新興有機污染物控制北京市重點實驗室，北京 100084）

抗生素是現代臨床應用最廣泛的藥物，在控制感染傳播、治療感染性疾病過程中發揮著至關重要的作用。抗生素不僅應用于人類疾病治療，還用于畜牧業和水產養殖業。在家畜飼養中，除了用于治療動物的傳染病，還用作常規飼料添加劑[1]。抗生素的大量生產和應用，已使其成為水環境中檢測到最多的新型污染物[2-4]。調查顯示，全球許多地區的土壤和水體中都檢測到抗生素藥物，且種類較多，濃度呈升高趨勢[5]。進入環境中的抗生素，可改變環境中微生物種類，破壞生態系統的平衡[6]，也可誘導出抗藥菌株[7]，通過食物等途徑進入人體，對人類健康產生危害[8-9]。

重金屬是環境中典型的污染物之一，微量濃度的重金屬就可產生毒性作用[10-11]。因具有富集性和不易降解性，且對環境中的生物甚至人類健康產生有害影響，重金屬污染已成為最難解決的環境問題之一，成了人們關注的熱點[12]。抗生素和重金屬這兩種環境污染物，在環境中經常同時被檢測到[13-14]。水體中的重金屬和抗生素可能會以各種形態和濃度共存，形成各種各樣的混合污染物[15-16]。混合污染物產生的累積毒性與相互作用可能會對生態環境、甚至生物健康產生更大危害[17-19]，如張雨[20]和王瑞等[21]研究發現抗生素-金屬復合物之間的絡合作用會改變抗生素的環境行為和生態毒理作用，絡合物的毒性最強。因此，開展抗生素與重金屬的聯合毒性作用研究具有重要的實際環境意義。

越來越多的研究表明，除濃度外，暴露時間是影響污染物毒性的另一個重要因素，且不同的污染物隨時間可能有不同的毒性變化規律[22-24]。如氨基糖苷類抗生素及其混合物對青海弧菌（Vibrio qinghaisiense sp.-Q67，Q67）的毒性隨著時間的延長而逐漸增加，而有的污染物毒性卻隨暴露時間的延長逐漸減弱[25-28]。因此，要考察污染物的毒性，必須全面系統采集這些污染物在不同暴露時間對暴露生物的毒性數據才能揭示污染物間發生毒性相互作用（協同或拮抗作用）的機制，才能客觀準確評價環境污染物的潛在風險[29-30]。目前針對重金屬或抗生素在某一特定暴露時間的單一毒性效應的研究已有報道[31-32]，但關于二者復合污染的聯合毒性相互作用的研究，尤其關于抗生素與重金屬的多元污染物聯合毒性相互作用隨時間變化的動態規律的研究非常有限[33-35]。

因此，本文以抗生素和重金屬為研究對象，以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為檢測生物，采用均勻設計射線法設計抗生素與重金屬的多元（九元）混合污染物體系，應用已建立的時間依賴微板毒性分析法（t-MTA）系統測定抗生素和重金屬及其混合污染物體系對蛋白核小球藻的生長抑制率[36]，運用經典參考模型濃度加和（Concentration addtion，CA）分析混合物在不同暴露時間的毒性相互作用（協同或拮抗作用），并揭示抗生素與重金屬聯合毒性相互作用變化規律，為科學評價重金屬以及抗生素可能產生的風險提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

5種抗生素分別為硫酸阿米卡星（Amikacin sulfate，AMI）、硫酸慶大霉素（Gentamycin sulfate，GEN）、硫酸卡那霉素（Kanamycin sulfate，KAN）、硫酸巴龍霉素（Paromomycin sulfate，PAR）、妥布霉素（Tobramycin，TOB），購自上海原葉生物科技有限公司，理化性質列于表1中。4種重金屬分別為氯化鎘、五水合硫酸銅、四水合氯化錳、七水合硫酸鋅，均為分析純，均購置于國藥集團化學試劑有限公司，理化性質列于表1中。

重金屬和抗生素的儲備液均用超純水（Reverses Osmosis）配制，并于4℃冰箱中保存、備用。

主要儀器：Bio-RAD 680型酶標儀（美國Bio-RAD伯樂儀器有限公司），超凈工作臺（三發儀器有限公司），YX280A手提式壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司），MGC-250智能型光照培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），FA1004型五位電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

表1 實驗用抗生素與重金屬的理化性質Table 1 Physi-chemical propertiesof antibiotics and heavy metals

1.2 藻種與培養

實驗藻種：蛋白核小球藻購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫（FACHB），藻的培養基配制及其培養過程參見文獻[24]和[32]。

1.3 混合物實驗設計

采用均勻設計射線法（UD-Ray）[37]設計抗生素與重金屬的混合物體系，共安排10條九元混合物射線（R1~R10），每條混合物射線包含的抗生素和重金屬組分和各組分的濃度配比（pi）及每條混合物射線的最高和最低設定濃度見表2。

表2 九元混合物體系中10條射線的組分及其所占濃度比（pi）Table2 Thecomponentsand their concentration ratiostogether with thehighesand lowest experimental concentration of ten raysin nine-component mixturesystem

1.4 微板設計與時間毒性測試

微板設計與毒性測試過程參考文獻[24]：在96孔透明微板（Corning，9018）的四周24孔中加入200μL蒸餾水以防止邊緣效應，于2、6、7、11列的24孔中加入100μL的蒸餾水，在余下孔加入事先配好的12個不同濃度的污染物儲備液100μL，然后加入事先培養至對數期的蛋白核小球藻溶液100μL，最后加透明蓋，然后將微孔板置于溫度為25℃、照度為5000 lx、光暗比14 h∶10 h的光照培養箱中培養，分別在暴露時間 t=0、12、24、48、72 h 和 96 h 時將微板放入酶標儀中，測定690 nm波長下的光密度（OD690）。針對每一個毒物，上述微板實驗操作至少重復3遍。

小球藻生長抑制率的計算公式如下：

式中：Ei，j為污染物濃度ci（i=1、2、3、…、12）在暴露時間終點j（j=0、12、24、48、72、96 h）對小球藻的生長速率抑制率；μi，j為微板中污染物濃度ci處理孔中小球藻在暴露時間終點j時的平均生長速率；μ0，j為微板中空白藻在暴露時間終點j（j=0、12、24、48、72、96 h）的平均生長速率。μj為微板孔中小球藻在某一暴露時間j（j=0、12、24、48、72、96 h）的平均生長速率；OD690，n為微板孔中小球藻在第n個暴露時間點（n=0、1、2、3、4、5、6）的平均吸光光度值；OD690，n-1為微板孔中小球藻在第n-1個暴露時間點的平均吸光光度值。

1.5 時間毒性數據擬合

實驗數據處理方法參見文獻[24]。將獲得的在不同暴露時間污染物的濃度-抑制率數據運用兩參數Logit函數進行非線模擬合。

式中：E表示效應（0≤E≤1）；c表示單個化合物或者混合物濃度；α和β都是參數。

由于毒性實驗的固有誤差，評估化合物或混合物毒性時必須考察置信區間的范圍，特別是觀測值的置信區間（OCI）。OCI主要用于表征實驗數據的不確定度。本論文中，OCI是基于實測毒性效應，在顯著性水平為0.05情況下，化合物實驗濃度的可信范圍，即化合物產生某一效應x%時的95%OCI。并且本文是在整個濃度-效應區域內建立整條OCI曲線。

1.6 混合物毒性相互作用分析

混合物毒性相互作用常常是參考某一標準加和參考模型來定義的，濃度加和（CA）模型能用來評估大多數混合物的毒性[38-39]。

CA模型的公式表達為：

式中：ci表示混合物中產生某一效應x%時組分i的濃度；ECx，i表示混合物中第i個化合物單獨存在時所產生的效應與混合物總效應x%相同時的濃度。當觀測毒性等于、大于或小于參考模型預測毒性時，分別稱混合物發生了加和作用、協同作用和拮抗作用。

2 結果與討論

2.1 抗生素與重金屬對蛋白核小球藻的時間毒性

不同污染物的毒性隨暴露時間具有不同的變化規律[40-41]。圖1是5種抗生素和4種重金屬對蛋白核小球藻在不同暴露時間的濃度-效應曲線（CRC）。從圖1可以看出，抗生素和重金屬對小球藻的毒性均隨著暴露時間的延長而逐漸增強，呈現出時間依賴性。不同物質對小球藻毒性隨時間變化的規律不同，如AMI、GEN、KAN、PAR、Cd、Mn 和 Zn 均是從 0 時刻的沒有明顯毒性逐漸增強，但每個物質毒性增強的速率不同，在各個暴露時間點，幾個物質的毒性不同，如在96 h，PAR的最大抑制率超過了90%，AMI和GEN的最大抑制率超過了80%，KAN、Mn和Zn的最大抑制率約60%。TOB在前三個時間點幾乎沒有毒性，72 h后在高濃度才有明顯毒性，96 h的最高抑制率迅速達到了70%。而Cd和Cu具有急性毒性，即在12 h就呈現出了30%以上的抑制率，此后Cu的毒性逐漸增加，72 h后最大抑制率達到90%以上，此后幾乎不再增加，Cd的最大抑制率在12 h后迅速增加達到了70%以上，此后增加緩慢，72 h后幾乎不再增加。

研究表明，重金屬對藻的毒性主要是通過改變運動器的細微結構，使核酸組成發生變化，影響細胞生長和縮小細胞體[42]。氨基糖苷類抗生素的毒性作用是損害細胞膜，使細胞漿外漏，并作用于核糖體阻抑蛋白質合成，影響細胞生長[43]。由此可以看出本研究中兩種污染物對蛋白核小球藻的毒性作用機理相似，可以比較同一暴露時間節點的毒性大小。以pEC50值（半數效應濃度EC50的負對數）為毒性指標，污染物在同一暴露時間的毒性不同，且毒性大小順序隨著暴露時間延長而變化，如在12 h所有物質的pEC50值均為0，在24 h除了Cd有pEC50值，其余8種物質的pEC50值均為0，在48 h，三種物質的毒性大小順序為PAR＜Cd＜Cu，其余 6種物質的 pEC50值均為 0，72 h時KAN和TOB的pEC50值為0，其余7種物質的毒性大小順序為 Zn＜Mn＜Cd＜AMI＜GEN＜PAR＜Cu，96 h的毒性順序為 KAN＜TOB＜Zn＜Mn＜Cd＜AMI＜GEN＜Cu＜PAR。

2.2 抗生素-重金屬對蛋白核小球藻在不同時間點的聯合毒性

將抗生素與重金屬的九元混合物體系對蛋白核小球藻的濃度-效應數據及擬合CRC繪于圖2中。從圖2可以看出，抗生素和重金屬的九元混合物射線對蛋白核小球藻的毒性，均隨著暴露時間的延長逐漸增強，即具有時間依賴性，但不同濃度配比的混合物射線，毒性隨時間變化的規律略有不同。如R1、R2、R3、R8和R9的毒性均隨暴露時間的延長逐漸增強，24 h后增加速度較快，72h后增加速率減慢，96 h后幾乎不再增加，而余下的5條射線的毒性隨暴露時間的延長，只在開始的48h內迅速增加，此后毒性增加非常緩慢，96 h不再增加。九元混合物體系幾條射線的毒性較接近TOB的毒性，可能是由于TOB所占濃度比最高（表2），直接影響了混合物毒性隨時間的變化規律。

2.3 抗生素-重金屬多元混合物對蛋白核小球藻的聯合毒性相互作用

CA模型能較好地評估混合物毒性[39]。CA對10條射線在不同時間點的預測CRC與實驗CRC及其置信區間繪于圖3中。由于在暴露時間12 h和24 h內，部分組分（如TOB）沒有明顯的毒性，因此，圖3只給出了48 h后的濃度-效應關系圖。

圖1 抗生素和重金屬在不同暴露時間點的濃度-效應曲線Figure1 Theconcentration-effect curvesof antibioticsand heavy metalsat different exposuretime

從圖3可以看出，除了射線R5~R7的CA預測CRC部分落在實驗觀測置信區間的上方，表現為部分拮抗作用，其余射線的CA預測線都在實驗CRC置信區間的下方，呈現明顯的協同作用，但不同射線協同作用不同。R1~R3和R8、R9均呈現出明顯的協同作用，而R4和R10均在48 h呈現明顯的協同作用，且隨暴露時間的延長而逐漸減弱甚至變為加和作用，而R5~R7在暴露時間為48 h時，CA預測CRC都落在實驗CRC置信區間內，表現為經典的加和作用，隨后隨暴露時間的延長，CA預測線CRC落在了置信區間上限的上方，即呈現出拮抗作用，表明R5、R6和R7三條射線呈現出明顯的時間依賴性拮抗作用。如前所述，兩類物質作用于藻細胞的機理接近，因此大多數混合物射線呈現出明顯的協同作用。同時，由于抗生素分子中含有大量的羧基、羥基、氨等基團或電子供體原子，可與金屬離子發生絡合作用，這種絡合作用會在不同程度上改變混合污染物的環境行為和毒理效應，這可能使污染物的聯合毒性增強或減弱，即產生了協同或拮抗作用[20-21]。綜上所述，混合物的相互作用的毒性大小及其變化規律不僅與組分的濃度比有關，也會隨暴露時間變化而變化，這就要求我們在揭示污染物相互作用規律時，要同時考慮濃度與時間兩個因素，提高生態風險評估的可信度。

3 結論

（1）9種污染物對蛋白核小球藻的毒性具有明顯的時間依賴性，但不同物質對其毒性隨時間變化的規律不同，毒性大小順序也隨時間不斷變化。

（2）抗生素和重金屬的九元混合物體系對蛋白核小球藻具有時間依賴毒性，且毒性的大小隨暴露時間的延長而增強，前48 h內毒性顯著增強，在48~96 h內，毒性增加幅度減小。

（3）10條抗生素和重金屬的九元混合物射線對蛋白核小球藻的毒性具有時間依賴性協同或拮抗作用，射線R1~R3和R8~R9均呈現出隨時間的延長而逐漸減弱的協同作用，而射線R5~R7呈現出隨時間的延長而逐漸趨于明顯的拮抗作用。

（4）混合物的毒性相互作用不僅與組分的濃度配比有關，也與暴露時間有關。

圖2 九元混合物體系在不同暴露時間點的濃度-效應曲線Figure2 Thecon centration-effect curvesof thenine-component mixturesystemsat different exposuretime

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圖3 呈毒性相互作用的混合物射線對蛋白核小球藻的濃度-效應關系Figure 3 Thenine-component mixturesystemsof toxic interaction of Chlorella pyrenoidosa concentration-effect relationship

續圖3 呈毒性相互作用的混合物射線對蛋白核小球藻的濃度-效應關系Continued figure 3 The nine-component mixture systemsof toxic interaction of Chlorella pyrenoidosa concentration-effect relationship

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