一株溶磷菌對鹽地堿蓬修復鹽漬土Cd污染的促進效應

林 欣，王立立，楊 平 ，李取生 *，徐智敏 ，2，魏 佳，周 婷

（1.暨南大學環境學院，廣州 510632；2.暨南大學生命科學技術學院，廣州 510632）

隨著灌溉鹽漬化、干旱鹽漬化、城市鹽漬化，以及咸水入侵等多種自然或人為的影響，全球受鹽漬化影響的土壤已達8.31億hm2[1-2]。由于施肥不當、污水灌溉、大氣Cd沉降等原因，許多鹽漬地又受到Cd污染[3-5]。植物修復具有成本低和環境友好等諸多優點，關于利用植物修復Cd污染土壤的應用研究卓有成效[6]，而對于受Cd污染的鹽漬土壤，如果采用多為非鹽生植物的Cd超富集植物，將導致修復過程中修復植物受到鹽分脅迫[7]，使修復效率降低。鹽地堿蓬是一種對鹽漬土壤環境有較強適應性的鹽生植物，同時其對Cd具有耐受性和富集能力[8]，可實現鹽分和Cd同步提取，對修復Cd污染的鹽漬地具有很大的潛力。

鹽漬土的特點之一就是土壤有效磷含量低[9]，而根際促生溶磷菌一方面可通過將土壤中難溶態磷轉換為植物可直接吸收利用的有效磷[10]，緩解因土壤缺磷而制約修復植物生長這一難題，另一方面其可分泌許多物質，其中的維生素、生長素和抗生素等也可直接或間接促進植物生長，同時其分泌的有機酸、表面活性劑、鐵載體等物質可活化土壤重金屬[11-13]，所以通過建立溶磷菌-鹽地堿蓬共生體系可從增加修復植物生物量和土壤溶液中離子態Cd濃度兩方面來強化植物修復。近些年不少有關溶磷菌-植物聯合修復的技術已運用于實際修復工程[14]，但將這類技術用于受Cd污染的鹽漬土壤的報道卻鮮見，因為鹽漬土壤環境對微生物生長有著極大的影響，在鹽分脅迫下有的根際微生物會死亡、微生物量降低以及種類減少，但也有的微生物具有很強的環境適應能力[15-16]，所以本研究試圖篩選出在鹽漬環境下仍能正常繁殖的溶磷菌，使其與修復植物形成共生關系，促進植物生長且提高植物修復效率。

本研究收集鹽地堿蓬根系分泌物作為篩選溶磷菌實驗中的唯一碳源，模擬土培鹽地堿蓬根際營養環境，挑選出生長最好的菌株先進行耐鹽性實驗，以期微生物接種到鹽漬土壤后在鹽分脅迫下仍能利用鹽地堿蓬根系分泌物為碳源生長繁殖，最終自然定殖于其根際，發揮其溶磷和活化Cd的作用。然后利用盆栽實驗進一步研究溶磷菌-鹽地堿蓬對Cd污染鹽漬土的聯合修復效應。為未來修復受Cd污染的鹽漬地提供科學參考。

1 實驗材料與方法

1.1 根系分泌物收集及定性

鹽地堿蓬（Suaeda salsa）種子（來源于中國科學院新疆生態與地理研究所）用石英砂育苗一個月后，將幼苗移至1/4霍格蘭營養液中曝氣水培，定期更換營養液時逐漸添加NaCl至2%。一個月后，用去離子水和無菌水洗凈根部并放入無菌水中，在曝氣光照的條件下水培6 h[17-18]，將水溶液過0.22μm濾膜，先后置于-80℃冰箱和冷凍干燥機中冷凍干燥至0.3 L，用GC-MS（SHIMADZU AOC-20i）外標法對根系分泌物進行定性和定量[19]。

1.2 溶磷菌的篩選和耐鹽實驗

供試的5株溶磷菌均來源于中國工業菌種保藏中心（CICC），分別是：不動桿菌（Acinetobacter，編號CICC10526）、大腸埃希菌（Escherichia，編號 CICC 10527）、陰溝腸桿菌（Enterobacter，編號 CICC10528）、綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis，編號CICC 21461），蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus，編號 CICC 23701）。所需培養基：（1）富集培養基（牛肉膏蛋白胨培養基）：將10 g細菌學蛋白胨、3 g牛肉膏、5 g NaCl溶于1 L水中，pH調節至7.0～7.5之間，滅菌備用。（2）根系分泌物培養基：向1 L去除葡萄糖和Ca（3PO4）2的蒙金娜液體培養基[20]添加0.256 2 g CaCl2、0.920 6 g KH2PO4，pH調節至7.0～7.5之間，滅菌后按體積比1∶1加入上述收集到的根系分泌物中（培養基的碳源濃度為 0.085 g·L-1），混勻備用。（3）無機磷功能培養基：將去除Ca3（PO4）2的蒙金娜液體培養基中的葡萄糖改為1 g，量取0.1 L上述溶液于裝有0.066 8 g Ca3（PO4）2和0.006 0 g CdCO3的錐形瓶中，pH調節至7.0～7.5之間，滅菌備用。

用牛肉膏蛋白胨培養基將5株菌于150 r·min-1、28℃的恒溫振蕩培養箱中富集后，取菌液用高速冷凍離心機于4000 r·min-1的條件下離心10 min，棄去上層清液，加入等體積無菌水，混勻，重復3次得重懸菌液。向裝有10 mL根系分泌物培養基的試管中加入0.2 mL菌懸液，加塞后放于與上述條件相同的培養箱中，每隔4 h取出一根試管用紫外分光光度計在600 nm條件下測定菌液OD值（以無菌水調零），取樣測定至40 h，繪制生長曲線。用葡萄糖含量為1 g·L-1的蒙金娜液體培養基分別培養5株溶磷菌，7 d后測定溶磷與活化Cd量。依據生長曲線與溶磷、活化Cd量挑選出最優后續供試菌株。

按上述方法將挑選出的菌株富集，分別向裝有100 mL 的 3 個 NaCl濃度（0.3、6、12 g·L-1）的無機磷功能培養基中加入2 mL菌懸液，每個NaCl濃度均設置不加菌的空白對照，每個處理4個重復，放于與上述條件相同的培養箱中，7 d后取出菌液用高速冷凍離心機于4000 r·min-1的條件下離心10 min，取上層清液過0.22μm濾膜，用鉬銻抗比色法[21]測定水溶性磷濃度，石墨爐原子吸收分光光度計（PE 900T）測Cd濃度，GC-MS分析[19]菌液代謝物。

1.3 盆栽實驗

將采集的污灌菜園土（pH為6.28，Cd平均總含量為 1.37 mg·kg-1，DTPA 提取態 Cd 含量為 0.57 mg·kg-1）曬干過篩，根據土壤干重質量和所需鹽分含量，將固體NaCl溶于去離子水后倒入土壤中拌勻，曬干，過篩。將育苗一個月后的鹽地堿蓬幼苗以3棵·盆-1移栽至裝有500 g土壤的花盆中，待植株成活后接菌，在 3 個鹽分梯度（0、4、8 g·kg-1）下分別設計接菌、不接菌處理，每個處理3個重復。接菌方式為：將挑選出的菌株制得的重懸菌液，以10 mL·棵-1的量用移液槍打入根部土壤中，不接菌處理以相同方式加入等體積無菌水，每10 d接菌一次并定期澆水，待生長至60 d收獲植株。收獲的植株用自來水和去離子水洗凈，置于烘箱中于75℃烘至恒重。稱取0.3 g粉碎后的干樣，加8 mL HNO3（質量分數為68%），用微波消解儀（CEM MARS6）消解，同時收集濕潤的附著于根際的土壤在轉速為6000 r·min-1的高速離心機中離心，取離心液過濾后用于測定根際溶液Cd含量[22]，用石墨爐原子吸收分光光度計測定土壤根際溶液和植物消解樣中Cd含量。

1.4 數據處理

采用植物生物量、根和莖葉Cd含量作為植物對Cd污染鹽漬地修復的分析指標。采用Microsoft Excel 2014和IBM SPSSstatistics 19.0進行數據整理和分析，采用Origin 9繪圖。

總活化量（μg·盆-1）=植物中 Cd 含量（μg·盆-1）+根際溶液 Cd 含量（μg·盆-1）

富集系數=植物地上部 Cd 含量（mg·kg-1）/土壤中對應形態 Cd 含量（mg·kg-1）

轉運系數=地上部 Cd 含量（mg·kg-1）/根部 Cd 含量（mg·kg-1）

2 實驗結果

2.1 鹽分處理下鹽地堿蓬的根系分泌物GC-MS分析

鹽地堿蓬根系分泌物中檢測出的有機物種類和含量如表1所示，16種物質中，甘油的濃度最高，為1.741 mmol·L-1，是其余物質的 9～262 倍，濃度最低的物質為鄰苯二甲酸，為0.007 mmol·L-1。

表1 鹽地堿蓬根系分泌物GC-MS分析結果Table 1 Quantitative and qualitative result of root exudates of Suaedasalsa

2.2 不同溶磷菌對根系分泌物碳源響應

圖1 5株溶磷菌在根系分泌物培養基中的生長曲線Figure 1 The growth curve of fivephosphate-solubilizingbacteria in culturesolution with root exudatesof Suaedasalsa

如圖1所示，5株菌都能在以鹽地堿蓬根系分泌物為唯一碳源的培養基中生長，且均在10 h附近達到穩定期。大腸埃希菌穩定期的OD值最大，為0.53。陰溝腸桿菌穩定期的OD值最小，為0.32。大腸埃希菌、不動桿菌、綠針假單胞菌和蠟狀芽孢桿菌生長曲線較為接近，但不動桿菌和陰溝腸桿菌的生長曲線在28 h后有下降趨勢。如表2所示，綠針假單胞菌和蠟狀芽孢桿菌溶磷與活化Cd的能力顯著低于其余菌株，加之大腸埃希菌溶磷和活化Cd的能力較其余菌表現出顯著優勢，綜上所述，選擇大腸埃希菌為后續供試菌株。

2.3 不同鹽分處理下大腸埃希菌對Ca3（PO4）2和CdCO3的溶解作用及代謝差異

表2 5株溶磷菌溶磷和活化Cd的能力Table 2 The ability of dissolved phosphorusand mobilized cadmiumof five phosphate-solubilizing bacteria

圖2 大腸埃希菌的耐鹽實驗結果Figure 2 Salinity tolerant of Escherichia

將大腸埃希菌做耐鹽搖瓶實驗，實驗結果如圖2所示，隨鹽分的增加，接菌較不接菌處理下溶磷和活化Cd量均顯著增加（P<0.05），其中兩個處理間溶磷量相差2.0~2.4倍，活化Cd量相差4.5～12倍。從低到高的3個鹽分處理平均溶磷能力絕對值（扣除不接菌對照值）分別為80.19、78.79、77.54 mg·L-1，平均絕對活化 Cd 量依次為 17.84、17.30、19.73 mg·L-1。綜上所述，鹽分不會阻礙本實驗菌株的溶磷和活化Cd能力。

不同鹽分處理下大腸埃希菌的代謝物存在明顯的差異，如表3所示，丁酸、4-氨基丁酸、亮氨酸、焦谷氨酸、蛋氨酸、絡氨酸、棕櫚酸在0.3 g·L-1鹽分處理下未被檢測到，而在6、12 g·L-1鹽分處理下均被檢測到。正癸醇、衣康酸、己糖酸、戊糖酸、對羥基苯甲酸、異丙基蘋果酸只在12 g·L-1鹽分處理下被檢測到。在0.3、6、12 g·L-1鹽分處理下，大腸埃希菌分泌的有機酸分別為2、4、8種，分泌的氨基酸分別為4、8、8種，統計分泌的有機物分別為7、15、19種。

表3 不同鹽分處理下大腸埃希菌的代謝產物Table 3 The metabolitesof Escherichia under different salt treatments

2.4 盆栽實驗

圖3 不同處理下鹽地堿蓬生物量Figure 3 Aboveground biomassof Suaeda salsa under different treatments

如圖3所示，總體而言，鹽分含量與鹽地堿蓬生物量呈正相關，一定鹽分有利于其生長，這與前期研究結果一致。在接菌、不接菌處理中，3個鹽分條件下植物的生物量均存在顯著差異（P<0.05），其中4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的生物量最大。在0、4 g·kg-1鹽分條件下，接菌顯著促進了植物生長（P<0.05），其地上部生物量分別是不接菌的1.36倍和1.30倍，而8 g·kg-1鹽分條件下，接菌處理的生物量較不接菌處理顯著減少22%（P<0.05）。

如圖4所示，隨鹽分濃度的增加，不接菌條件下根際溶液Cd含量顯著增加（P<0.05）。3個鹽分條件下，接菌均增加了土壤溶液中Cd含量，但只有4 g·kg-1鹽分條件下，接菌與不接菌處理間存在顯著差異（P<0.05）。在所有處理中，4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的根際溶液中Cd含量最高，是其余處理的1.41～194倍。

圖4 不同處理下鹽地堿蓬根際溶液Cd含量Figure 4 The Cd concentration in rhizosphere soil solution of Suaeda salsa under different treatments

表4 不同鹽分處理下接菌、不接菌Cd富集系數與轉運系數Table 4 Accumulation and transfer factor of Suaeda salsa under the different treatments

圖5 不同處理下植物中Cd含量Figure 5 The Cd concentration in Suaeda salsa under different treatments

如表4所示，接菌、不接菌處理中，根部Cd為4、8 g·kg-1鹽分處理比無鹽分處理顯著增加（P<0.05，圖5）。3個鹽分條件下，接菌與不接菌處理間根部Cd含量無顯著差異。不接菌處理中，3個鹽分條件下莖葉Cd 含量均有顯著差異（P<0.05），4、8 g·kg-1鹽分條件下，接菌處理的莖葉Cd含量顯著高于不接菌處理（P<0.05）。4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的根、莖葉Cd含量均為所有處理中最高，分別是其余處理的1.02～4倍和1.01～4.18倍。

綜上，植物體內Cd的分布差異表明Cd的吸收在不同處理間存在差異。如表4所示，鹽分促進了植物對Cd的富集，但在相同鹽分條件下，接菌處理也同樣促進了Cd富集。4 g·kg-1鹽分條件下，接菌處理的全量Cd富集系數最大，且與不接菌的處理間存在顯著差異（P<0.05）。Cd在土壤中的生物毒性不僅與其總量有關，在很大程度上是取決于它們在土壤中的化學形態，尤其是生物有效態，實驗研究了DTPA提取態Cd的富集系數，發現其均比全量Cd的富集系數高，但二者在不同處理間表現出相同的規律。4、8 g·kg-1鹽分條件下，接菌處理顯著提高了Cd轉運系數（P<0.05）。4、8 g·kg-1鹽分條件接菌處理下Cd總活化量、全量Cd富集系數和DTPA提取態Cd富集系數均較不接菌處理高，且在所有處理中4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的各項指標均為最高，鹽分顯著促進了土壤Cd的活化（P<0.05），促進了植物對Cd的吸收累積。

3 討論

溶磷菌自然定殖于鹽地堿蓬根際土壤是其促進修復Cd污染鹽漬地的保障。一方面，本論文模擬鹽地堿蓬根際營養環境，將5株溶磷菌在相同濃度鹽地堿蓬根系分泌物為唯一碳源的培養基中培養，所供試的5株溶磷菌均能生長但呈現出不同生長趨勢。出現此結果的原因可能是因為實驗收集的鹽地堿蓬根系分泌物中7種有機酸均屬于短鏈低分子有機酸，容易透過細菌較薄的細胞壁和細胞膜，作為能源物質被細菌利用[23]，且16種物質都含有親水基團，不會與細胞壁結合和干擾細胞膜的通透性[24]，其次，本實驗所用的鹽地堿蓬根系分泌物中以甘油的量最多，且遠超其余物質。甘油作為一種微生物可利用的碳源[25]，可合成脂肪酸，也可以進入戊糖-磷酸途徑（HMP）而后進入三羧酸循環（TCA），產生能量和有用的代謝產物供給細菌生長繁殖。許多生物代謝工程研究中發現大腸埃希菌能利用甘油比較好地生長[26-27]，這與本實驗用甘油含量最多的鹽地堿蓬根系分泌物篩選出大腸埃希菌的結果一致。另一方面，結合5株溶磷菌的溶磷和活化Cd的能力，篩選出既能利用鹽地堿蓬生長較好，又具備較好溶磷和活化Cd能力的大腸埃希菌。

大腸埃希菌在 3 個鹽分處理下（0.3、6、12 g·L-1）的溶磷和活化Cd結果顯示，隨鹽分的增加，菌株平均絕對溶磷率依次為（扣除不接菌對照值）60.7%、60.9%、58.5%，呈先增后減的趨勢，說明大腸埃希菌具有一定的耐鹽性，但高濃度的鹽分可能抑制細菌正常生長。因為太低的NaCl濃度可能不能滿足溶磷菌對Na+的吸收，而NaCl濃度過高則會增加培養液的滲透勢，從而破壞微生物細胞結構[28]。黃明達等[29]在對溶磷菌條件的優化實驗中發現碳源、氮源的類型和濃度固定時，增加NaCl濃度，細菌的溶磷能力出現先增加后下降的趨勢。實驗中還發現，隨著鹽分濃度的增加，大腸埃希菌代謝產物從濃度和種類上均發生了顯著變化。在6、12 g·L-1鹽分脅迫下，細菌代謝氨基酸的種類均是0.3 g·L-1鹽分脅迫下的2倍，其中纈氨酸和苯基丙氨酸的量隨鹽分增加而顯著增加（P<0.05），異亮氨酸則呈現相反的趨勢。有研究表明當受到鹽分脅迫時，細胞可通過誘導信號分子分泌氨基酸代謝物，增加細胞膜不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例而改變細胞膜的通透性，以此來應對NaCl脅迫后的滲透壓[30]。因此，大腸埃希菌可能通過調節自身代謝途徑增強氨基酸代謝通路，適應鹽分脅迫環境。在6、12 g·L-1鹽分脅迫下，大腸埃希菌代謝有機酸的種類分別是0.3 g·L-1鹽分脅迫下的2、4倍，隨鹽分增強的有機酸代謝通路可能是其對鹽分脅迫環境的反饋，可能因為乳酸在細胞抗高滲脅迫過程中起重要作用[31]，所以隨鹽分的增加，較快的乳酸合成和消耗速率導致乳酸代謝途徑增強，乳酸合成代謝過程中產生了更多種類的有機酸。此外，在接菌處理間碳酸鎘的溶解量隨鹽分的增加顯著增加（P<0.05），可能是由于細菌隨鹽分脅迫增強而顯著增加的氨基酸和有機酸增強了碳酸鎘的活化。有研究表明氨基酸中天冬氨酸、組氨酸、谷氨酸對碳酸鎘具有較強的活化能力[32]。雖然隨著鹽分的增加，接菌與不接菌的溶Cd量均顯著增加（P<0.05），但在相同的鹽分處理下，接菌的處理溶Cd量依然顯著高于（P<0.05）不接菌的處理。說明在鹽分脅迫下，該溶磷菌株仍能正常發揮活化Cd的作用。對挑選出的大腸埃希菌進行耐鹽實驗，實驗結果證明其具有一定的耐鹽性，可以推測接種到鹽漬地的大腸埃希菌能適應鹽分脅迫環境，進一步保障其能自然定殖于生長在鹽漬土壤中的鹽地堿蓬根際。

在將菌株接于鹽地堿蓬根際的盆栽實驗中，0、4 g·kg-1鹽分條件下，接菌處理的生物量較不接菌處理的生物量顯著增大（P<0.05），可能接種到根際的菌株在一定程度通過溶磷或分泌生長激素等促進植物生長。根際溶液Cd活化量的增加是土培盆栽實驗中鹽地堿蓬Cd累積顯著增加的重要原因，4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的根際溶液Cd含量顯著高于（P<0.05）其余處理，此外8 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的生物量和根際Cd含量均沒達到預期的顯著效果，推測原因可能是因為土壤高濃度的鹽分一方面導致土壤板結不利于植物根系生長和吸收養分，另一方面導致土壤微生物群落發生改變不利于大腸埃希菌定殖生長[33]。4、8 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的Cd總活化量、全量Cd富集系數和DTPA態Cd富集系數比不接菌處理顯著增加（P<0.05），其中4 g·kg-1鹽分條件下接菌處理的Cd總活化量顯著高于8 g·kg-1鹽分條件下接菌處理（P<0.05）?？傮w看來，即使在鹽分的脅迫下具有耐鹽性能的大腸埃希菌也可以在鹽地堿蓬根際定殖，并通過溶磷和活化Cd的功能提高鹽地堿蓬對受Cd污染鹽漬土的修復效率，其中在4 g·kg-1鹽分條件下效果最顯著。

4 結論

（1）大腸埃希菌可利用鹽地堿蓬根系分泌物作為唯一碳源正常生長繁殖。

（2）大腸埃希菌具有一定的耐鹽性，在鹽分脅迫下仍能發揮溶磷、活化Cd的功能。

（3）大腸埃希菌可促進鹽地堿蓬的生長并增強其對土壤中Cd的富集。

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