納米銀對四種不同性質土壤微生物量及酶活性的影響

舒昆慧，張 麗，伍玲麗，司友斌，劉沁雪

（安徽農業大學資源與環境學院，農田生態保育與污染防控安徽省重點實驗室，合肥 230036）

銀納米粒子（AgNPs）是經濟合作與發展組織（OECD）列出的需要優先進行安全性研究的納米材料之一[1]，因其獨特的廣譜抗菌性被廣泛應用于生產生活中。隨著含納米銀產品消費量的增加，空氣、水、土壤及生物體暴露于納米銀環境的幾率增加[2]。調查顯示，2010年全球所生產的26萬~30.9萬t納米材料有63%~91%以垃圾填埋的方式處理，剩余的排入土壤（8%~28%）、水體（0.4%~7%）和大氣（0.1%~1.5%）[3]。模型預測納米銀在土壤和污泥中的濃度分別為0.02、4.4 mg·kg-1[4-5]，而美國環境保護署（EPA）在污泥中測得的銀離子濃度范圍為2~195 mg·kg-1，平均值為（20±22）mg·kg-1[6]?；钚晕勰嘣诒挥糜谵r田肥料、固廢填埋或在廢物處理廠進行焚燒的過程中會導致納米銀進入陸生系統，同時通過雨水淋洗進入下層土壤或者地下水中[7]。水生生物可能因廢水中出現納米銀顆粒受到傷害[8]，納米銀也會通過污泥農用影響土壤環境[9]。

最近的研究表明納米顆粒在土壤中的積累可能影響微生物的活性和多樣性。比如納米氧化鋅（ZnO）具有破壞土壤中常見細菌銅綠假單胞菌的能力[10]；含Ag140μg·kg-1修飾的有機污泥能使土壤中柔枝莠竹（Microstegium vimeneum）的生物量降低 32%[11]；濃度為 32μg·kg-1和 320μg·kg-1的納米銀顯著降低土壤中微生物的生物量[12]。目前，人們對納米銀的研究主要集中在微生物毒性方面，對納米銀直接作用于土壤環境的研究很少。大多數研究表明納米銀的毒性主要來自于釋放的銀離子和其自身的特異性效應，如氧化應激和細菌的直接作用[13]等，納米銀的反應性和殺菌性能則取決于其尺寸、形狀和形態[14]。銀對土壤有機物和硫醇化合物具有高親和力，可能對土壤微生物產生直接的影響，對富含氨基酸的土壤酶產生間接影響[15]。納米銀對土壤的污染可以通過生物地球化學過程表現出來，包括營養循環和大部分微生物介導的過程。

土壤是一個由礦物、有機顆粒與液相、氣相結合組成的復雜多孔體系，土壤環境（包括土壤生物、有機質等）與納米材料相互作用，改變其表面性質，進而影響納米材料的反應活性、穩定性、移動性、生物有效性乃至毒性[16-17]。這些復雜的相互作用顯著影響了土壤生態系統中納米材料環境行為與環境效應，增加了納米材料生態風險評估的不確定性，亟需更深入的研究[18]。

本文通過外源添加納米銀的方式，研究納米銀對不同性質土壤中微生物數量、底物呼吸及不同種類酶活性的影響，并利用統計分析等手段進一步探究土壤特性與納米銀毒性之間的關系，為納米銀的土壤環境影響評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

納米銀粉末，購于南京埃瑞普納米材料有限公司，純度≥99%?；疑骄?0~80 nm、比表面積2.5~15 m2·g-1、松裝密度 0.25~0.6 g·m-3，無包裹，其形態和粒徑如圖1所示。

1.1.2 土壤樣品采集

土壤樣品分別采自安徽合肥的水稻土、黃棕壤、黃褐土以及廣東肇慶的磚紅壤，采樣深度為0~20 cm。采集土樣后及時揀出可見植物殘體、根系及土壤動物，風干后過20目篩，充分混勻裝袋，備用，供試土壤基本理化性質見表1。

1.2 試驗設計

圖1 納米銀TEM圖（A）和粒徑分布圖（B）Figure 1 TEMimage（A）and distribution of particulate sizes（B）of silver nanoparticles

根據美國EPA調查推測施用污泥農田土壤納米銀可累積到10 mg·kg-1，據此本試驗設計土壤納米銀為低（10mg·kg-1）、中（50mg·kg-1）、高（100mg·kg-1）3種劑量。將土壤樣品置于28℃恒溫恒濕培養箱中培育一周，培養期間稱重法調節土壤含水量，使其保持一致。培養結束后，采用干混法將納米銀與少量風干土混合均勻后再加入新鮮過篩土壤，使得土壤中納米銀含量分別為10、50、100 mg·kg-1干土，不加納米銀土壤為對照，每處理3次重復。調節土壤含水量至田間最大持水量60%，置于28℃恒溫恒濕培養箱中繼續培養，按時取樣。

表1 供試土壤的基本理化性質Table 1 Basic physical and chemical properties of the experimental soils

1.2.1 土壤可培養微生物數量測定

供試土壤培養7 d后，采用系列稀釋平板培養法對不同劑量納米銀暴露土壤樣品分別進行細菌、真菌、放線菌數量的測定，培養基分別為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、馬丁氏培養基及改良高氏一號培養基。

1.2.2 土壤微生物多樣性測定

稱取0.5 g培養7 d含不同劑量納米銀的黃褐土，按照FastDNA SPINKit for soil試劑盒進行土壤微生物總DNA的提取，利用通用引物（515F-907R）擴增土壤微生物DNA的16SrRNA基因，采用Illumina MiSeq platform測序平臺對V4區進行測序[19-20]。

1.2.3 土壤誘導呼吸測定

稱取20.0 g（干土）不同劑量納米銀處理7 d的土壤樣品，分別放入250 mL錐形瓶中，加入葡萄糖粉劑（6 mg·g-1干土），反應30 min后用密封膠將錐形瓶密封，置于25℃培養箱中培養2 h。培養結束后用注射器抽取5 mL氣體樣品采用氣相色譜儀測定CO2含量。土壤誘導呼吸量為單位時間（h）內單位烘干土壤（g）釋放的CO2（μL）含量[21]。

1.2.4 土壤酶活性測定

供試土壤培養7 d后取樣測定土壤脲酶、蔗糖酶、熒光素二乙酸酯酶（FDA酶）、過氧化氫酶活性，測定方法參見《土壤與環境微生物研究法》[21]。土壤脲酶測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以每克土壤24 h酶解尿素產生銨態氮（NH+4-N）的毫克數來表示；FDA酶采用比色法測定，其活性以每克土20 min內生成的熒光素表示；蔗糖酶采用二硝基水楊酸比色法測定，其活性以37℃下每克土24 h后的葡萄糖量表示；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定，其活性以每克土30 min分解H2O2的毫克數表示。

1.3 數據處理與分析

利用Excel 2007處理實驗數據，SPSS 18.0分析數據，以Canoco 4.5軟件完成變量之間的PCA相關性分析，采用Origin 8.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 納米銀對土壤可培養微生物數量的影響

納米銀對不同性質土壤中可培養微生物數量產生不同程度影響（圖2）。水稻土中細菌數量在低劑量（10 mg·kg-1）納米銀處理下顯著降低，中高劑量（50、100 mg·kg-1）處理顯著低于低劑量處理，但不同劑量納米銀對放線菌、真菌的影響均不顯著。低劑量納米銀對黃棕壤可培養微生物影響較小，中高劑量下細菌、放線菌、真菌數量顯著降低。不同劑量納米銀顯著抑制黃褐土中可培養微生物的生長，隨著納米銀劑量的增加抑制作用也逐漸增強。低劑量納米處理下，黃褐土中放線菌、真菌數量分別減少86.8%和58.3%，而中高劑量下細菌、放線菌、真菌數量都減少80%以上，可見黃褐土中微生物對納米銀極為敏感。納米銀對磚紅壤的影響與黃褐土相似，不同的是納米銀對磚紅壤微生物的抑制強度略低于黃褐土。

從結果可以看出水稻土中對納米銀最敏感的是細菌，黃棕壤中微生物對納米銀有一定的耐受力，高劑量下才會有所減少，黃褐土、磚紅壤中微生物對納米銀都很敏感，尤其是高劑量納米銀處理下，微生物數量出現大幅降低。因此，供試4種土壤可培養微生物對納米銀的敏感程度為黃褐土>磚紅壤>水稻土>黃棕壤。

2.2 納米銀對土壤微生物多樣性的影響

通過對黃褐土微生物16SrRNA基因MiSeq高通量測序，得到微生物門水平的相對豐度。不同劑量納米銀對黃褐土微生物主要門類沒有明顯影響，但對微生物群落豐度產生影響（圖3）。納米銀暴露的土壤中變形菌門（Proteobacteria，25.4%~35.9%）、酸桿菌門（Acidobacteria，23.7%~30.1%）和放線菌門（Actinobacteria，10.3%~14.1%）為土壤的主導微生物門類，約占所有微生物總豐度的60%以上。其中螺旋菌門（Nitrospirae，1.6%~2.2%）、厚壁菌門（Firmicutes，3.7%~6.6%）、藍菌門（Cyanobacteria，0.4%~2.6%）、放線菌門（Actinobacteria，10.3%~14.1%）、酸桿菌門（Acidobacteria，23.7%~30.1%）對納米銀敏感度較高，隨著納米銀劑量增加群落豐度下降。土壤納米銀含量為50 mg·kg-1時，土壤中酸桿菌門群落相較于對照豐度下降了25.1%，而變形菌門群落相較于對照組豐度上升了41.3%。浮霉菌門（Planctomycetes）和芽孢單菌門（Gemmatimonadetes）群落豐度隨納米銀含量增加而上升。同時，綠彎菌門（Chloroflexi）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在不同納米銀含量土壤中群落豐度變化不大。

圖2 納米銀對土壤微生物數量的影響gNPs on soil microbial quantity

圖3 納米銀處理對黃褐土微生物群落結構的影響Figure3 Effect of different contents AgNPstreatment on microflora in yellowcinnamon soils

2.3 納米銀對土壤呼吸的影響

土壤誘導呼吸量可以反映出土壤生物量的大小（圖4）。通過對納米銀暴露7 d的土壤進行底物誘導呼吸，發現4種土壤中納米銀處理組呼吸強度均低于對照組，并且隨著納米銀劑量的增加，呼吸作用逐漸減弱。低劑量納米銀處理下，土壤呼吸作用沒有受到顯著影響，中高劑量納米銀顯著抑制土壤呼吸，高劑量下水稻土、黃棕壤、黃褐土、磚紅壤呼吸作用分別降低23.8%、15.9%、29.3%、14.5%。可見，納米銀的加入會減少土壤生物量，導致土壤微生物過程減弱，這與高通量測序的結果相一致。

2.4 納米銀對土壤酶活性的影響

添加不同劑量納米銀對4種土壤酶活性產生不同程度的影響（圖5）。低劑量納米銀處理下，水稻土的脲酶、FDA酶，黃棕壤的蔗糖酶活性有明顯的升高；黃褐土、磚紅壤酶活性降低。中劑量納米銀處理下，4種土壤脲酶、蔗糖酶活性顯著降低，水稻土和黃棕壤的FDA酶、過氧化氫酶，黃褐土FDA酶活性受到輕微抑制，未達到顯著影響。高劑量納米銀處理下，水稻土和黃棕壤的脲酶、蔗糖酶，黃褐土脲酶、蔗糖酶、過氧化氫酶，以及磚紅壤酶活性均顯著降低。說明納米銀的添加會影響土壤微生物酶過程，并且這種影響與納米銀的劑量正相關。

圖4 納米銀對土壤誘導呼吸量的影響Figure 4 Effect of AgNPs on substrate induced respiration in soils

圖5 不同納米銀處理下土壤酶活性Figure 5 Effect of different contents AgNPson enzyme activities in soils

此外，納米銀對不同種類酶的影響也不相同，脲酶對納米銀最為敏感，其次是蔗糖酶。高劑量下土壤脲酶活性降低41.7%~54.0%，蔗糖酶活性降低24.5%~40.8%。雖然磚紅壤FDA酶在高劑量納米銀下活性降低27.8%，但水稻土、黃棕壤、黃褐土中酶活性抑制均不顯著（降低4.5%~7.2%）。納米銀對過氧化氫酶的影響在黃褐土、磚紅壤中較為顯著，在水稻土、黃棕壤中影響較小。

2.5 土壤環境因子與微生物性狀因子之間的相關性分析

加入納米銀后土壤理化性質沒有發生明顯變化，但納米銀在不同土壤中的微生物毒性卻有著較大差異。中劑量（50 mg·kg-1）納米銀處理下土壤各微生物性狀因子抑制率（與對照相比）與環境因子進行相關性分析，由表2可知納米銀對呼吸作用的抑制與土壤pH正相關，對脲酶、蔗糖酶的抑制與土壤pH值、CEC正相關，對FDA酶、過氧化氫酶及真菌的抑制與土壤有機質、砂粒含量有一定的相關性，而對細菌、放線菌的抑制與環境因子相關性不高。土壤黏粒含量與各微生物性狀因子之間的相關性不高，可能是因為供試土壤黏粒含量較為接近，在分析時無法顯示出較大的差別。

環境因子與微生物性狀因子主成分分析如圖6所示，軸1和軸2的變量解釋因子為96.5%，土壤有機質、砂粒在軸1方向上與真菌、FDA酶、過氧化氫酶等變量相關性較高；土壤pH、CEC與脲酶、蔗糖酶相關性高，這與表2結果相似。說明納米銀在有機質、砂粒含量高的土壤中對FDA酶、過氧化氫酶的毒性作用大，而在pH、離子強度大的土壤中對脲酶、蔗糖酶及真菌的毒性大。納米銀對土壤呼吸作用的影響主要與土壤pH值相關，在pH值高的土壤中，納米銀對生物量的影響較大。

圖6 環境因子-微生物性狀因子的PCA分析Figure6 Principal component analysisof environmental factors and microbial traitsfactors

3 討論

土壤微生物是維持土壤肥力和作物生產的關鍵因素[22]，土壤生境的改變會影響微生物數量及群落結構的組成[23]。平板計數和底物誘導呼吸結果表明納米銀對土壤微生物的生長繁殖具有顯著抑制作用。納米銀暴露下土壤細菌、放線菌、真菌數量顯著降低，呼吸作用受到抑制，并且這種抑制在低劑量（10 mg·kg-1）下就有所表現，隨著納米銀劑量的增加抑制作用逐漸增強。研究發現10 mg·kg-1納米銀可以顯著降低土壤真菌的菌落數，100 mg·kg-1會顯著抑制土壤細菌及放線菌的數量[24]。當納米銀含量僅為0.14 mg·kg-1時，污泥中微生物生物量與細菌群落組成顯著減少[11]；土壤中納米銀濃度高于20 mg·kg-1時，土壤呼吸被明顯抑制，且濃度越高抑制作用越大[25]。納米銀能夠破壞細菌的細胞膜，并聚集在細胞膜中，增加細胞通透性，導致細胞死亡[26]；進入細胞內部的納米銀通過濃縮DNA使之失去復制能力，引起DNA降解從而抑制細菌生長繁殖[27]。

表2 環境因子與微生物性狀因子相關性Table 2 Correlation between environmental factorsand microbial traitsfactors

納米銀進入土壤后增加了細菌的豐富度但并沒有改變土壤中主導微生物群落（變形菌門和酸桿菌門）。除主導細菌群落外，螺旋菌門、厚壁菌門、藍菌門等隨納米銀劑量增加群落豐度下降，浮霉菌門和芽孢單菌門隨納米銀劑量增加群落豐度上升，綠彎菌門和擬桿菌門隨納米銀劑量增加群落豐度無明顯差異。說明土壤生境的變化不會改變主導細菌群落，但會引起群落豐度的變化，且不同細菌門類對納米銀的敏感程度不一樣。Kumar等[28]發現，納米銀對土壤微生物群落有較高毒性，并可改變群落組成豐度，特別是植物伴生菌；Yang等[29]研究表明，納米銀會對活性污泥的微生物群落產生抑制作用，對硝化細菌群落的抑制尤為顯著。

不同土壤中不同種類酶對納米銀的響應不同，但整體上土壤酶活性隨著納米銀劑量的增加而降低。在測定的4種酶中，納米銀對脲酶的抑制最為顯著，對蔗糖酶、FDA酶、過氧化氫酶活性也有一定程度的抑制，這與相關研究結果相似。Shin等[30]研究了納米銀對土壤6種酶活性的影響，發現脲酶對納米銀最敏感，而納米銀對FDA酶等影響較小。王秋雙等[24]研究顯示納米銀處理顯著抑制土壤脲酶、脫氫酶活性，卻對土壤過氧化氫酶與磷酸酶活性基本無影響。納米金屬的毒性可能來自于其本身，通過滅活蛋白質組或阻斷酶上的結合位點來抑制酶活性[31]，也可能是因其粒徑小，易進入微生物內部產生氧化應激，導致生物死亡。ROS（活性氧簇）的累積可能是導致脲酶、磷酸酶活性降低的主要原因[32]，而納米顆粒本身或其溶解的離子對于土壤生態系統是明顯有毒的[33]。

納米銀對土壤微生物的毒性與土壤理化性質有一定的關系，土壤pH、有機質含量、黏粒分布等都會影響納米銀在土壤中的聚合狀態和穩定性。研究發現納米ZnO的毒性是由離子釋放導致的，納米ZnO對念珠菌的毒性與土壤pH有關，在酸性土壤中毒性更強[34]。也有研究表明納米銀在酸性土壤中的毒性要強于堿性土壤[35]。這可能是因為酸性土壤表面的電負性低，對帶負電的納米銀靜電排斥力更小[36]，易與納米銀結合，從而降低了納米銀在土壤中的遷移性，毒性作用更持久。此外，土壤天然有機質的表面吸附能夠防止納米銀的氧化和銀離子釋放，腐植酸、富里酸能將氧化產物轉化成金屬從而抑制納米銀的溶解[37]。但也有研究發現用有機質修飾和未用有機質修飾的土壤中溶解Ag的濃度是相似的[38]，而土壤質地越細，納米材料的保留率會提高，其生物有效性會降低[39]。因此，納米銀進入土壤環境后不僅形態、大小會發生改變，毒性作用也會受到影響，土壤性質則可能是其毒性變化的主要原因。

雖然本研究對納米銀在不同土壤中微生物毒性進行了探討，對納米銀的微生物毒性大小進行了測定，但是關于納米銀在土壤環境中的轉化及毒性作用過程尚不清楚，有待進一步研究。

4 結論

（1）納米銀能抑制土壤細菌、放線菌的數量，對真菌也有一定的抑制作用，劑量越高，抑制作用越明顯。

（2）納米銀抑制土壤微生物呼吸作用，使土壤生物量減少。

（3）納米銀對不同土壤中酶活性的影響存在顯著差異。納米銀顯著抑制黃褐土、磚紅壤中蔗糖酶、脲酶、FDA酶、過氧化氫酶活性；對水稻土、黃棕壤中脲酶影響較大，蔗糖酶、FDA酶、過氧化氫酶活性變化較小。

（4）納米銀毒性與土壤性質相關。納米銀對真菌、FDA酶、過氧化氫酶的抑制與土壤有機質、砂粒含量正相關；納米銀對脲酶、蔗糖酶、呼吸作用的抑制與土壤pH值、陽離子交換量正相關。

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