蘋果樹腐爛病菌揮發性代謝物及其毒素活性

李思南,秦 辰,王 惠,黃麗麗(.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 700；.西北農林科技大學 農學院，陜西楊凌 700；.西北農林科技大學 化學與藥學院，陜西楊凌 700；.西北農林科技大學 植物保護學院，旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 700)

蘋果樹腐爛病(ValsamaliMiyabe et Yamada),俗稱臭皮病、爛皮病、串皮病，是由黑腐皮殼屬(Valsamali)真菌引起的樹枝干皮層腐爛病害[1]，目前由于對其致病機理還不十分清楚，導致該病的防治比較盲目。為了搞清楚其致病機理，必須對其分泌的毒素活性物質進行研究。目前對蘋果樹腐爛病菌代謝產物的研究主要集中在酶類物質[2-4]、根皮苷的降解產物[5-7]、有機酸類[8]等。有研究還發現 ，蘋果樹腐爛病菌分泌的蛋白類物質也有致病活性[9]。但關于其發酵產生的揮發性成分是否在致病過程中具有作用尚未見報道。有研究表明生物體產生的一些揮發性代謝物質具有一定生物活性[10]。關于揮發性代謝產物的研究，當前主要用GC-MS方法[11]。旱區作物逆境生物學國家重點實驗室果樹病害病原生物學及綜合防控研究團隊曾利用該方法對蘋果樹腐爛病菌在MS培養基中的揮發性成分進行研究，并發現2個毒素活性成分。在此基礎上，進一步對該病菌在樹皮培養基中的揮發性成分進行分離提取,利用GC-MS對各個成分進行分離和結構定性，初步確定其代謝的揮發性成分與毒素活性的關系，以期為該病菌致病機理的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與培養基 菌株：蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)由西北農林科技大學植物病害綜合治理實驗室提供，4 ℃保存。

樹皮培養基：取蘋果樹皮150 g，葡萄糖10 g，于1 000 mL沸水中煮30 min，紗布過濾。

1.1.2 儀器與試劑 氣相色譜-質譜聯用儀: QP201V1tra型。乙酸乙酯：質譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；異戊醇，2-苯乙醇，4-乙基苯酚，4-乙基-2-甲氧基苯酚均為市售分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 培養濾液的制備 先將蘋果樹腐爛病菌接種至PDA培養基上，于25 ℃培養3 d。再用直徑5 cm的打孔器沿菌落邊緣打出菌株長勢均勻的菌餅，接種于樹皮培養基中，并設置一空白對照，置于25 ℃進行培養，每天搖瓶20 min(120 r/min)，培養15 d。用布氏漏斗抽濾得到培養濾液。

1.2.2 培養濾液中揮發性代謝產物的收集 取上述培養濾液300 mL于圓底燒瓶中，進行普通蒸餾，用10 mL乙酸乙酯收集餾分，收集液封口保存于4 ℃冷藏箱中。各進行3次重現試驗。

1.2.3 揮發性代謝產物的定性分析 取上述收集液在如下GC-MS條件下進行分析測定，通過與譜庫標準物質質譜圖對照初步確定收集液中各成分的結構。GC-MS條件：石英毛細管柱(30.0 m×0.25 mm)，升溫程序40～90 ℃(3 ℃/min)，90～230 ℃(10 ℃/min，230 ℃保留3 min)，進樣口溫度240 ℃，進樣量2 μL，載氣He，進樣方式為不分流，柱流量1.11 mL/min，吹掃流量3 mL/min。EI源，離子源溫度200 ℃，接口溫度220 ℃，電子能量70 eV，掃描質量范圍：50～500。

1.2.4 4種揮發性物質的標準物質的毒素活性測定方法 蘋果樹枝條的準備：取粗細和長短相等且長勢相近的健康蘋果樹枝30支，用φ=0.6% 的次氯酸鈉溶液浸泡10 min進行消毒，然后用無菌水漂洗3次，于超凈工作臺上晾干，用石蠟封在形態學上端以防止過多水分散失，用濕潤棉花包裹形態學下端保濕，保證試驗過程中枝條存活。

活性測定：先用灼燒后的打孔器在每個枝條中間表面造成傷口，然后用微量注射器在枝條傷口處分別滴異戊醇10 μL、2-苯乙醇10 μL、4-乙基苯酚10 μg、4-乙基-2-甲氧基苯酚10 μL，每個樣品處理3個枝條。以未滴加任何物質的帶傷枝條和傷口處接蘋果樹腐爛病菌菌餅的枝條分別作為對照(ck-a和ck-b)，保存在密封的培養皿中，置于25 ℃恒溫室中培養，80 h后進行病斑大小測定。病斑大小以長直徑與短直徑的乘積表示。

1.2.5 數據分析 用SPSS軟件(SPSS 16.0版)進行統計分析，采用LSD法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性代謝產物成分分析

用GC-MS對供試菌株的培養濾液收集液和純培養基濾液收集液分別進行定性分析，得到的色譜圖見圖1。從圖1可以看出，供試菌株的培養濾液收集液與純培養基濾液收集液(ck)相比，前者明顯多出①、②、③、④ 和 ⑤ 5個色譜峰，表明供試菌株產生揮發性物質。圖2-A、2-B、2-C和圖3-A、3-B分別是圖1中①、②、③、④ 和 ⑤ 相應的質譜圖及譜庫中相似度較高的相應標準物質質譜圖，其相應的中英文名稱見圖2和圖3注，對應的各物質的結構見圖4。

對照 CK：純培養基揮發性成分 Volatile ingredients in pure medium；樣品 Sample：菌株培養濾液揮發性成分 Volatile ingredients in culture filtrate

圖1蘋果樹腐爛病菌樹皮培養基培養濾液中揮發性代謝物的色譜圖

Fig.1ChromatographyspectraofvolatilemetabolitesinculturefiltrateofValsamali

2.2 4種揮發性物質的標準物質對蘋果樹枝條的毒素活性測定結果

利用蘋果枝條作為生測對象，檢測4種揮發性物質的標準物質的生物活性，結果見圖5。可以看出，圖5-B的病斑明顯大于圖5-A，說明本試驗中的蘋果樹腐爛病菌具有明顯的致病性。 另外，圖5-A枝條上沒有顯示出病斑，表明只有傷口不會產生病斑，而在傷口上分別滴加4種物質處理(圖5-C、5-D、5-E和5-F)的枝條上明顯有病斑出現，表明4種化合物均對蘋果樹枝具有毒素活性。

對圖5中各處理的致病斑面積進行統計，結果見表1。表1中的5-A與處理5-C、5-D、5-E和5-F均差異顯著(P<0.05)，進一步表明異戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚對蘋果樹枝均具有明顯的毒素活性。

A.“2-氟-1-丙烯”及標準物質質譜圖 Mass spectra of 2-fluoro-1-propene and standard compound； B.“異戊醇”及標準物質質譜圖 Mass spectra of 3-methylbutan-1-ol and standard compound； C.“2-苯乙醇“及標準物質質譜圖 Mass spectra of 2-phenylethan-1-ol and standard compound

圖2蘋果樹腐爛病菌樹皮培養基發酵液揮發性代謝產物中組分的質譜圖及其數據庫標準物質質譜圖

Fig.2ThemassspectrumofvolatilemetabolitefromValsamaliinmediumwithapple-tree-rindandstandardcompound

A.“4-乙基-2-甲氧基-苯酚”及標準物質質譜圖 Mass spectra of 4-ethyl-2-methoxyphenol and standard compound； B.“4-乙基苯酚或3-乙基苯酚”及標準物質質譜圖 Mass spectra of 4-ethylphenol or 3-ethylphenol and standard compound

圖3蘋果樹腐爛病菌樹皮培養基發酵液揮發性代謝產物中組分的質譜圖及其數據庫標準物質質譜圖

Fig.3ThemassspectrumofvolatilemetabolitefromValsamaliinmediumwithapple-tree-rindandstandardcompound

圖4 蘋果樹腐爛病菌樹皮培養濾液中5種揮發性代謝物的結構

A.僅在蘋果枝條上造成傷口 Only a wound on the apple branches；B.在蘋果枝條上造成傷口并接菌餅(蘋果樹腐爛病菌) A wound on the apple branches and inoculatedValsamali；C.處理為在蘋果枝條上造成傷口并滴加異戊醇試劑 A wound on the apple branches and drop the 3-methylbutan-1-ol；D.在蘋果枝條上造成傷口并滴加2-苯乙醇 A wound on the apple branches and drop the 2-phenylethan-1-ol；E.在蘋果枝條上造成傷口并滴加4-乙基苯酚 A wound on the apple branches and drop the 4-ethylphenol；F.在蘋果枝條上造成傷口并滴加4-乙基-2-甲氧基苯酚 A wound on the apple branches and drop the 4-ethyl-2-methoxyphenol

圖5 4種物質對蘋果枝條的壞死現象觀察結果

注：菌餅接種蘋果樹腐爛病菌；與ck-a相比,△:P<0.05；與ck-b相比, *:P<0.05。5-A、5-B、5-C、5-D、5-E和5-F同圖5的A、B、C、D、E和F。

Note:Agar disk containing mycelium inoculatedValsamali; compared with “ck-a”,△:P<0.05; compared with “ck-b”,*:P<0.05. 5-A，5-B，5-C，5-D，5-E and 5-F respectively correspond to A,B,C,D,E and F in Fig.5.

3 討 論

3.1 異戊醇、2-苯乙醇為蘋果樹腐爛病菌自身代謝的產物

蘋果樹腐爛病菌在樹皮培養基發酵濾液中分離得到異戊醇、2-苯乙醇兩種揮發性物質。在之前研究中, 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室果樹病害病原生物學及綜合防控研究團隊通過在MS液體培養基中培養蘋果樹腐爛病菌，采用普通蒸餾法收集其培養濾液中的揮發性代謝產物，利用GC-MS對各個成分進行初步結構定性，發現蘋果樹腐爛病菌在MS培養基發酵濾液中也分離得到異戊醇、2-苯乙醇這兩種揮發性物質，表明異戊醇、2-苯乙醇是蘋果樹腐爛病菌自身的代謝產物，與培養基無關。

3.2 2-氟丙烯、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚可能為蘋果樹腐爛病菌分解樹皮中物質產生的

蘋果樹腐爛病菌在樹皮培養基發酵液中分離得到2-氟丙烯、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚，這3種揮發性物質在MS培養基發酵濾液中尚未發現。表明這3種揮發性物質并非致病菌自身代謝產生。再者王建華等[5]、Natsume等[6]、Koganezawa等[7]都曾報道過蘋果樹腐爛病菌能分解樹皮中根皮苷。因此推測，這3種揮發性物質可能是蘋果樹腐爛病菌在自身生長過程中分解樹皮中的物質產生的。

3.3 異戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚是蘋果樹腐爛病菌代謝產生的毒素活性物質

本試驗發現，異戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚都對蘋果樹枝條表現出毒素活性，表明它們是蘋果樹腐爛病菌的毒素活性物質。本試驗檢測到2-氟丙烯這一揮發性物，因在市場上沒有購買到其分析純試劑，未進行毒素活性試驗。2-氟丙烯是否具有毒素活性，有待進一步研究。

4 結 論

本試驗以蘋果樹腐爛病菌為材料，結合普通蒸餾的方法和GC-MS聯用儀的使用，分離提取并分析蘋果樹腐爛病菌在樹皮培養基中培養產生的揮發性代謝產物。經分析得知，蘋果樹腐爛病菌在該條件下培養產生的揮發性代謝產物有5種，分別為2-氟丙烯、異戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚。利用蘋果枝條作為生測對象，對異戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚的標準物質進行生物毒素活性測定，發現該4種揮發性物質均對蘋果樹枝條具有毒素活性。本試驗首次發現蘋果樹腐爛病菌產生的揮發性代謝產物對蘋果樹具有毒素活性，為該致病菌致病機理的探索提供新的思路與方向。

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