Ⅰ群禽腺病毒Hexon蛋白的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立與應用

張 曼，韓 飛，高 睿，何亞鵬(楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西楊凌 712100)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAV)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3群，Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus group Ⅰ，FAV Ⅰ)具有共同的群抗原[1-2]。該群病毒代表株為雞胚致死孤兒病毒(Chicken embro lethal orphan virus，CELOV)[3]。近年來，由FAV Ⅰ引起的包涵體肝炎、心包積液綜合征和砂囊糜爛的感染呈上升趨勢[2,4-6]。特別是2015年6月以來，中國多個省份的雞群爆發安卡拉病(Angrara disease)，病原為Ⅰ群FAV中C種FAV-4型，該病主要特征為突然倒地，出現呼吸道癥狀，甩鼻、呼吸加快，排黃色稀糞，有神經癥狀，兩腿劃空，剖檢可見心包積液、肝臟腫大[5-6]。該病主要發生于3周齡的肉雞，發病后1周左右為死亡高峰期，死亡率可達20%～80%，短時間內就給禽類養殖造成重大損失[7]。此外，腺病毒既可經卵垂直傳遞，污染雞胚，也可經排泄物水平傳播，給防控帶來巨大的困難[1]。對FAV Ⅰ傳統的實驗室診斷方法如分離與鑒定、中和試驗、瓊脂糖凝膠免疫擴散試驗等方法費時耗力，結果不夠精確，PCR、LAMP等對試劑和設備要求較高且不便對大量樣品進行檢測[7-9]，酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)作為經典的、應用最廣的血清學診斷方法，具有操作簡便、特異性強、敏感性高和成本低廉等優點，可以為Ⅰ群禽腺病毒疫苗免疫效果檢測和未免疫雞群的疾病診斷提供方法[10]。

六鄰體蛋白Hexon是FAVⅠ的主要結構蛋白，位于FAVⅠ的外殼，Hexon蛋白含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的種特異性抗原決定簇，可以作為診斷抗原[3]。本研究分析FAVⅠHexon基因編碼蛋白的抗原指數和表面分布可能性，選擇Hexon蛋白前段抗原性強且具有群特異性的339個氨基酸進行原核表達，制備具有良好反應原性的抗原，對其進行大量誘導表達，將純化復性后的重組Hexon蛋白作為包被抗原，經過條件優化，建立檢測FAVⅠ血清抗體的間接ELISA方法，以期為Ⅰ群禽腺病毒疫苗免疫效果檢測和未免疫雞群的疾病診斷提供方法。

1 材料與方法

1.1 菌種、質粒、實驗動物、血清

FAVⅠ CELO毒株(CVCC AV208)購自中國獸藥監察所；pEASY-T1 Cloning Kit、感受態細胞Trans5α為北京全式金生物技術有限公司產品；pET-28a(+)質粒為Novagen公司產品；原核表達BL21(DE3)菌株為康為世紀生物公司產品；SPF雞(Specific pathogen free chicken)購自楊凌綠方生物科技有限公司；FAV Ⅰ、雞新城疫病毒、禽流感病毒、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清由楊凌職業技術學院動物工程分院畜禽傳染病實驗室采集，采用ELISA方法或免疫膠體金試紙條鑒定并保存；279份雞血清樣品采自陜西省4個地區的規模化養雞場。

1.2 主要試劑

2×EsTaqMasterMix、DM2000 plus DNA marker、廣譜蛋白Marker購于北京康為世紀生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；內切酶購于Fermentas公司；T4DNA連接酶購于大連寶生物公司；預染蛋白Marker Blue PlusⅡ Protein Marker、ProteinIso Ni-NTA Resin購于北京全式金生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG(Rabbit Anti-chicken IgG/HRP antibody)購于北京博奧森生物技術有限公司；酶標板購自BEAVER公司；TMB儲存液(2 mg/mL)由楊凌職業技術學院動物工程分院畜禽傳染病實驗室配制，現配現用；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.3 Hexon基因的擴增和表達載體構建

根據GenBank 中收錄的FAV Ⅰ(CELO Phelps株，GenBank登錄號U46933.1)Hexon基因序列，利用Primer 5.0軟件，設計引物，上游引物HexonF-BamHⅠ:5′-CGCGGATCCATGAC- TGCGCTTA-CTCCCGA-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點)，HexonR-XhoⅠ:5′-CCGCTCGAG- CGCCAGCATGTACTGGTAAC-3′(下劃線為XhoⅠ酶切位點)，位置為18 289～19 305 bp，擴增長度為1 017 bp，引物由Invitrogen公司合成。

以FAVⅠ的DNA為模板，進行PCR擴增。切膠回收目的條帶，連接pEASY-T1Cloning載體，獲得T1-Hexon陽性質粒，送華大基因(北京)測序。雙酶切T1-Hexon和pET-28a(+)質粒，回收酶切產物，將目的基因Hexon連接到pET-28a(+)載體中，PCR選取陽性克隆，然后雙酶切鑒定，并進行質粒測序，序列正確的質粒命名為pET-Hexon。

1.4 Hexon蛋白的原核表達

pET-Hexon轉化BL21(DE3)感受態細胞，對誘導劑濃度(IPTG 終濃度 0～1.0 mmol/L)和誘導時間進行優化，收集并處理樣品，然后進行SDS-PAGE分析。

1.5 Hexon蛋白的純化、復性

誘導培養1 L重組菌，收集菌體，裂解收集包涵體蛋白，按ProteinIso Ni-NTA Resin說明書操作純化目的蛋白Hexon。

配制透析液進行蛋白復性，透析液A、B、C均含有20 mmol/L Tris-HCl，其他組分為：透析液A(分別加入6、4、2和1 mol/L的尿素，調pH為8.0)、透析液B(0.6 mmol/L L-精氨酸，φ=10%的甘油，2 mmol/L EDTA，0.5 mol/L，調pH為8.0)和透析液C(25 mmol/L NaCl，0.2 mol/L尿素)。將純化后的Hexon重組蛋白轉入透析袋中，依照尿素濃度從高到低的順序放入透析液A中，然后依次放入透析液B、透析液C中，在4 ℃環境中磁力攪拌透析復性，每個透析液中放置10 h。測定復性后的Hexon重組蛋白的質量濃度，分裝保存于-20 ℃。

1.6 重組蛋白的Western blot 分析

對純化后的Hexon蛋白進行SDS-PAGE，轉膜封閉后，用1∶500倍稀釋的一抗(雞FAV Ⅰ陽性血清)于4 ℃孵育過夜后，用1∶10 000倍稀釋的二抗(HRP標記的兔抗雞 IgG 抗體)孵育2 h后，ECL反應液孵育，暗室中壓片曝光。

1.7 間接ELISA檢測方法的建立與初步應用

1.7.1 間接ELISA方法 用0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將純化后的抗原稀釋至所需質量濃度，以每孔100 μL的包被量加入96孔ELISA板中，用保鮮膜封孔頂，置4 ℃過夜；次日，用PBST洗液(pH 7.4)洗滌3次(每次5 min)、拍干；加入封閉液(含50 g/L脫脂奶粉的PBST)，每孔200 μL，37 ℃ 1 h，棄去封閉液；加入血清樣品(用含50 g/L脫脂奶粉的PBST稀釋)，每孔100 μL，37 ℃ 1 h，同樣方法洗板、拍干；加酶標二抗(用含50 g/L脫脂奶粉的PBST稀釋)，每孔100 μL，37 ℃ 1 h后，同樣方法洗板、拍干；每孔加入100 μL的TMB，避光孵育15 min；每孔加入3 mol/L的濃硫酸50 μL終止反應后，用酶標儀測定每孔的OD450值。

1.7.2 抗原、血清和酶標二抗最佳稀釋度的確定 用純化后的Hexon蛋白、血清以及酶標二抗進行正交試驗，將抗原(Hexon蛋白)分別稀釋至質量濃度為2.5、5.0和7.5 mg/L，每孔100 μL包被至ELISA板中；陰陽性血清樣品以1∶50、1∶100、1∶200和1∶400倍稀釋；酶標二抗以1∶2 500、1∶5 000和1∶10 000倍稀釋；每孔設置2個重復取平均值，同時設立陰陽性和空白對照。進行ELISA檢測，測定各孔OD450值后進行數據分析。取陽性樣品OD450值(P值)約為1.0，陰性樣品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大時，為最佳抗原包被量及血清和二抗稀釋度。

1.7.3 作用時間的優化 以抗原、血清和酶標二抗最佳作用濃度為基礎，優化抗原的最佳封閉時間(37 ℃，1、1.5、2 h)、血清反應時間(37 ℃，0.5、1、1.5 h)、酶標二抗最佳孵育時間(37 ℃，0.5 、1、1.5 h)以及最佳顯色時間(37 ℃，10、20、30 min)等條件，取陽性樣品OD450值(P值)約為1.0，陰性樣品OD450值(N值)在0.1左右，并且P/N值最大時，為最佳作用時間。

1.7.5 特異性試驗 取雞新城疫、禽流感、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清樣品進行檢測，統計分析結果。

1.7.6 敏感性試驗 將FAV Ⅰ陽性血清以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 200、1∶1 600倍稀釋，用建立的ELISA方法檢測。在最優條件下，用建立的間接ELISA對70份FAVⅠ陽性血清樣品(經進口ELISA試劑盒檢測為陽性)進行檢測，統計分析陽性血清的檢出率。

1.7.7 重復性試驗 取FAVⅠ陽性血清和陰性血清各3份，在同一條件下，用已建立的最佳間接ELISA檢測方法進行檢測，每份血清設置4個重復，根據每孔的OD450值，分析其批次內的可重復性。用3個批次純化復性的Hexon蛋白包被酶標板檢測1份陽性血清，根據每孔的OD450值，分析批次間的可重復性。

1.7.8 臨床樣品檢測 用已建立的檢測方法檢測陜西省4個地區規模化養雞場的279份雞血清樣品，評價該ELISA檢測方法的檢測效果。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增和重組質粒雙酶切鑒定

PCR擴增得到1 017 bp的目的基因Hexon。將Hexon基因連接至pET-28a(+)，重組質粒pET-Hexon進行雙酶切，獲得預期的片段(圖1)。

M. DM2000 plus DNA marker；1.Hexon基因擴增產物 Production ofHexongene;；2. pET-Hexon雙酶切分析 Restriction enzyme analysis of recombanant r plasmid pET-Hexon

圖1重組質粒酶切鑒定

Fig.1Restrictionanalysisofrecombinantplasmid

2.2 重組蛋白的原核表達與純化

原核表達誘導劑IPTG濃度優化結果顯示，當IPTG終濃度為0.25～1.0 mmol/L時，重組蛋白Hexon表達量一致，選擇誘導劑IPTG濃度為0.25～1.0 mmol/L均可；全部采用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導5 h，重組蛋白Hexon可大量表達，而pET-Hexon未誘導，對照沒有重組蛋白的表達。在最佳誘導條件下，分別取菌體超聲裂解上清、菌體超聲裂解沉淀進行SDS-PAGE，結果顯示Hexon重組蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體蛋白經ProteinIso Ni-NTA Resin純化并復性后均獲得37.4 ku大小的Hexon重組蛋白(圖2)。

M. 蛋白marker Protein marker；1. 未誘導pET-Hexon Uninduced BL21 (DE3) containing pET-Hexon；2. 誘導5 h的pET-Hexon BL21 (DE3) containing pET-Hexon induced for 5 h；3.pET-Hexon菌體裂解上清 Supernate of the lysed recombinantEcoliBL21 (DE3) of pET-Hexon ；4.pET-Hexon菌體裂解沉淀 Precipiate of the lysed recombinantEcoliBL21 (DE3) of pET-Hexon；5. 純化的Hexon重組蛋白 Purification of Hexon fusion protein

圖2Hexon重組蛋白SDS-PAGE分析

Fig.2SDS-PAGEanalysisofofHexonfusionprotein

2.3 重組蛋白的Westernblot分析

Westernblot結果表明，Hexon重組蛋白能與FAVⅠ陽性血清發生特異性反應，出現大小為37.4 ku的條帶，而與SPF雞血清無特異性條帶出現，無特異性反應(圖3)。

M. 預染蛋白 Marker Blue plus Ⅱ protein marker；1. FAVⅠ陽性血清 FAVⅠpositive chicken sera；2. SPF雞血清 SPF chicken sera

圖3Hexon重組蛋白的Westernblot分析

Fig.3WesternblotanalysisofHexonfusionprotein

2.4 間接ELISA檢測方法的建立

2.4.1 抗原包被量及血清和酶標二抗最佳稀釋度的確定 多次正交試驗結果顯示，當抗原Hexon重組蛋白的質量濃度為5.0 mg/L，血清稀釋度為1∶ 200，酶標二抗的稀釋度為1∶5 000時為最佳條件(表1)。

表1 抗原包被量、血清和酶標二抗工作濃度的確定

注：A代表抗原的質量濃度為2.50 mg/L，B代表抗原的質量濃度為5.0 mg/L，C代表抗原的質量濃度為7.50 mg/L。

Notes： A.mass concentrations of antigen is 2.50 mg/L；B.mass concentrations of antigen is 5.0 mg/L； C.mass concentrations of antigen is 7.50 mg/L.

2.4.2 作用時間的優化 當抗原質量濃度為5.0 mg/L，包被量為每孔100 μL，封閉條件為37 ℃作用1 h，血清以1∶200倍稀釋37 ℃作用1 h，酶標二抗以1∶5 000倍稀釋37 ℃作用1 h，每孔100 μL的TMB 37 ℃孵育10 min時效果最佳。

2.4.4 特異性試驗 用建立的間接ELISA檢測雞新城疫、禽流感、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清樣品進行檢測，結果OD450值均小于0.3，為陰性，陰、陽性對照成立，表明檢測方法特異性良好(表2)。

2.4.5 敏感性試驗 將FAV Ⅰ陽性血清以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 200、1∶1 600 稀釋，用建立的ELISA方法檢測，結果當陽性血清以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 200稀釋時，結果為陽性，當陽性血清以1∶1 600稀釋時，結果為陰性(表3)；并且用建立的間接ELISA對70份FAVⅠ陽性血清樣品(經進口ELISA試劑盒檢測為陽性)進行檢測，有2份未檢出，檢出陽性率為97.1%，表明所建立的檢測方法敏感性良好。

表2 特異性試驗

表3 敏感性試驗結果

2.4.6 重復性試驗 在建立的最優條件下，檢測3份陽性血清和3份陰性血清的OD450值，結果表明，OD450值批內變異系數為1.2%～3.5%；分別用3批次純化復性的Hexon蛋白檢測1份陽性血清和1份陰性血清，結果表明，OD450值批間變異系數為5.1%～8.3%。批內變異系數和批間變異系數都較小，表明建立的檢測方法具有良好的重復性。

2.4.7 臨床樣品檢測 對采自不同地區規模化養雞場的279份雞血清樣品進行Hexon蛋白抗體水平的檢測。結果表明，143份血清為陽性，陽性率為51.3%(表4)。

表4 陜西省4個地區雞血清Hexon抗體水平檢測

3 討 論

近年來，由FAVⅠ引起的包涵體肝炎、心包積液綜合征和砂囊糜爛的感染呈上升趨勢[11-12]。特別是2015年6月以來，中國多數省份的雞群爆發安卡拉病，發病率和病死率高，給禽雞類養殖造成嚴重危害[5,13]。因此建立靈敏度高、特異性強且能快速、安全、有效的檢測雞腺病毒血清抗體的ELISA檢測方法至關重要。

本試驗針對FAVⅠ的Hexon基因進行分析，選取Hexon蛋白主要抗原區的序列，構建原核表達質粒pET-Hexon，轉化大腸埃希菌BL21(DE3)后，對其進行大量的誘導表達，經表達形式分析，該蛋白主要以包涵體形式存在。將純化復性后的重組Hexon蛋白作為包被抗原，抗原質量濃度為5.0 mg/L，包被量為每孔100 μL，血清最佳稀釋度為1∶200，二抗最佳稀釋度為1∶5 000，建立間接ELISA抗體水平檢測試驗。試驗結果顯示，該檢測方法具有較強的特異性，不能與雞新城疫、禽流感、沙門菌、金黃色葡萄球菌、多殺性巴氏桿菌和大腸埃希菌陽性血清發生反應；批間和批內重復性試驗結果可以看出，其變異系數小，重復性好；敏感性試驗結果顯示，該試驗敏感性強；并且本試驗方法操作簡單快速，成本低，適合大量樣品檢測。對采自不同地區規模化養雞場的279份雞血清樣品進行Hexon蛋白抗體水平的檢測，檢測結果顯示143份血清為陽性，陽性率為51.3%。在以后的臨床檢測應用中，可以對腺病毒疫苗免疫雞群的免疫效果進行檢測評估，也可以應用該方法對未免疫雞群的感染情況進行調查。

在現在的養殖生產中“以防為主，防重于治”是防控疾病的基本原則，疫苗的免疫極為重要。因此，間接ELISA檢測方法的建立為開展腺病毒疫苗免疫效果評估及未免疫雞群疾病診斷提供技術支持，促進雞包涵體肝炎和安卡拉等相關雞病的有效防治。

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