滇中不同植被類型土壤甲烷氧化及其碳同位素分餾特征

張曉艷，徐華，馬靜，劉梅先

1. 湖南第一師范學院，湖南 長沙410205；2. 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室//中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008；3. 中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙410125；4. 中國科學院環江喀斯特生態系統觀測研究站，廣西 環江 547100

全球變暖是備受關注的環境問題。特別是近些年來，全球范圍內極端氣候事件的頻發，進一步促使人們關注和研究以全球變暖為主導的氣候變化（Asadieh et al.，2015；Shi et al.，2015）。全球變暖的主要誘因之一是大氣溫室氣體濃度升高，特別是進入工業化時代（約 1750年）以來，由于科學技術的跨步式發展，人類對自然的干擾能力逐漸增強，如化石燃料的大規模開采使用、森林植被破壞、高強度的化肥施用以及如氟利昂等合成物的大規模使用等，導致二氧化碳、甲烷、氧化亞氮等溫室氣體的不平衡排放，是造成全球變暖的重要原因。CH4是僅次于CO2的重要溫室氣體，對全球溫室效應的貢獻約達18%（IPCC，2007）。

土壤甲烷氧化在調節大氣CH4濃度、區域生態系統碳氮過程中具有重要地位（IPCC，2001）。即使在長期漬水的稻田土壤，其產生的CH4也有大部分被土壤 CH4氧化菌所氧化（張曉艷等，2016）。但由于土壤CH4氧化微生物較敏感，土壤甲烷氧化能力受到如土壤透氣性、有機質含量、氮素、降水、溫度、pH以及管理方式等諸多因素的影響（鄧湘雯等，2012；張丹丹等，2017）。其中，植被類型可以通過多種途徑影響土壤性質，不同植被類型土壤在有機質含量、養分和活性成分等方面都存在一定差異。這些差異都密切關系到土壤甲烷氧化菌種群結構和活力（Conrad，2007；李超男等，2017）。重要的是，陸地生態系統正是由不同植被復合而成。因此，明確不同植被類型土壤甲烷氧化能力，對準確估算溫室氣體排放具有重要意義。針對此，國內外已開展了大量研究，并進一步探討了諸如pH、氮濃度和形態、溫度等眾多因素對其所產生的影響（Ishizuka et al.，2000；Strieg et al.，1992；劉惠等，2008；劉實等，2010）。

然而，目前對土壤 CH4氧化及其影響因素的認識還不充分，有些現象和結論存在一定爭議，例如關于銨態氮和硝態氮對土壤甲烷氧化所產生的作用是刺激或是抑制仍有爭論（Adamsen et al.，1993；程淑蘭等，2012，王智平等，2003）。同時，這些研究大多基于通量觀測進行的，關于土壤甲烷氧化同位素分餾的報道尚不多見（Tyler et al.，1994；Zhang et al.，2015；張曉艷等，2016）。但是，了解土壤甲烷氧化碳同位素分餾特征，對認識土壤甲烷氧化機理具有重要意義。因此，本文以滇中颯馬場小流域以及附近化佛山自然保護區為研究對象，選取了 6種典型植被類型土壤，基于室內好氧培養試驗研究了不同土壤甲烷氧化速率、碳同位素分餾特性及其與土壤性質的關系，以期為調控土壤甲烷氧化、溫室氣體減排提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

樣地位于滇中高原楚雄州牟定縣鳳屯鄉颯馬場小流域（101°28′E，25°24′N）及附近化佛山自然保護區。當地屬北亞熱帶濕潤季風氣候，年平均氣溫15.7 ℃，年降雨量800～1300 mm，干濕季分明，降雨主要集中在5—10月（約80%）。當地土壤主要為由紫紅色頁巖發育而成的紫色沙土。颯馬場小流域的原生植被于上世紀50年代遭到毀壞，之后在“飛播造林”和“退耕還林”等措施下陸續形成了如今的多種次生性或人工性植被。基于勘察，于颯馬場小流域選取了針葉林、針闊混交林、常綠闊葉林、草地及稻田5種植被類型，并于化佛山自然保護區內選取1種典型植被（常綠闊葉林，文中記為原始林）進行研究。不同植被類型（稻田除外）主要物種如表1所示（張國盛等，2011；張穎等，2012）。所有土壤樣品均采集于2012年6月。每塊樣地采集3個表層（0～20 cm）重復樣品，并立即帶回實驗室處理，備用。

1.2 好氧培養試驗方法

取50 g土樣于三角瓶中，分別加入去離子水調節土壤含水量至85% WHC（土壤持水量），密封瓶口。加入高純CH4至濃度為10000 μL·L-1，并放入培養箱黑暗條件下預培養1周。預培養結束后打開瓶塞，與外界通氣一晚后再次密封，注入高純CH4至濃度為10000 μL·L-1，放入恒溫培養箱暗培養30 min后測定瓶內CH4濃度和δ13CH4，分別記為初始CH4濃度和初始δ13C濃度。之后每隔一定時間取樣測定CH4濃度和δ13CH4，取樣間隔時間取決于CH4濃度下降情況。其中CH4濃度分析一般為1天1～2次，而δ13CH4則在試驗開始和CH4濃度降至約為初始濃度的3/4、1/2和1/4時取樣測定。

1.3 土壤理化性質分析

本文所測定的土壤理化性質指標包括 NH4+-N（銨態氮）、NO3--N（硝態氮）、可溶性有機碳（DOC）、pH、有機碳、全氮、活性鐵、活性鋁、活性錳和土壤持水量（WHC）。其中，土壤NH4+-N和NO3--N首先用2 mol·L-1KCl溶液（土水比為1∶5）在250 r·min-1下振蕩提取 1 h，過濾后用連續流動分析儀（Skalar，Holland）測定；土壤可溶性有機碳（DOC）首先配置土水比（V/m）為1∶5的懸濁液（10 g干土樣），常溫振蕩浸提30 min并高速離心20 min（8000 r·min-1），過濾后（0.45 μm）用總有機碳分析儀（Multi N/C 3000）測定；土壤pH則先用去離子水配置水土為2.5∶1（V/m）土壤懸濁液，用pH計（pHs-3C）測定；土壤有機碳和全氮采用 N/CN元素分析儀（Vario Max CN）測定；土壤活性鐵、活性鋁、活性錳先用草酸-草酸銨緩沖溶液（pH=3.2）提取，提取液用電感耦合等離子體發射光譜儀（Optima 8000）測定；把通過 20目篩的土樣置于用棉球塞住的漏斗中，加去離子水浸泡 2 h，加蓋，除去棉塞放置過夜后測定土壤持水量（WHC）。

1.4 數據分析

CH4氧化速率（Ψox）由以下公式計算：

式中，Ψox為 CH4氧化速率，μg·g-1·d-1；dc/dt為培養瓶內氣相 CH4濃度單位時間的變化，μL·L-1·d-1；VH為培養瓶內上部空間的體積，L；ms為干土質量，g；Mm為CH4的摩爾質量，g；MV為標準狀態下摩爾體積，L；T為培養溫度，K。

表1 不同植被類型主要植物物種Table 1 The dominant species at the five sample sites

碳同位素分餾系數 αox采用以下公式計算（Coleman et al.，1981）：

式中，δCt=0是開始培養時CH4的δ13C的濃度；δCt是培養一定時間t后剩余CH4的δ13C的濃度；f是培養時間t時剩余CH4占外加總CH4量的比值。基于數據，本文計算了甲烷濃度降低至初始濃度的3/4、1/2和1/4時的Ψox和αox，以供分析。

本文的數據分析，包括相關分析、回歸分析、方差分析及標準偏差等均在統計軟件SPSS 15.0 for Windows（SPSS Inc.，Chicago）和 Microsoft Excel 2016中完成。

2 結果和討論

2.1 土壤基本理化性質

由表2可知，6種植被類型土壤均呈酸性且其pH極為接近（變異系數僅為3.2%）；同時，土壤活性鋁含量差異也相對較小，變異系數為13.4%；而TC（全碳）、TN（全氮）、NO3--N（硝態氮）、NH4+-N（銨態氮）、DOC（可溶性有機碳）、活性鐵和活性錳差異比較明顯，均在中等變異以上（C.V.>50%），特別是 NO3--N，達到強度變異（131.9%）。另外，稻田土壤NO3--N含量最高，應為人工施用氮肥所致；其余指標（除pH外）基本呈現原始林>稻田>針葉林>混交林>闊葉林>草地的規律（表2）。

2.2 土壤CH4氧化速率及碳同位素分餾特征

不同時段（甲烷濃度分別降低至初始濃度的3/4、1/2和1/4時），土壤CH4氧化速率Ψox和碳同位素分餾系數αox如圖1所示。據核算，原始林、針葉林、混交林、闊葉林和草地土壤的平均Ψox分別為 3.83、4.39、1.78、3.21 和 0.95 μg·g-1·d-1，均顯著低于稻田土壤的 10.75 μg·g-1·d-1（圖 1a）。該結果與已有研究互有異同，相似的如Tilman et al.（2001）也發現Ψox大小順序為森林土壤>耕地土壤>草原土壤；不同的如Ishizuka et al.（2000）、Menyailo et al.（2003）所發現的闊葉林土壤Ψox高于松林土壤（本文為針葉林土壤>闊葉林土壤）。這可能與植被年限、土壤質地、水熱條件的不同以及由此引起的土壤性質和微生物差異有關。同時，原始林、針葉林、混交林、闊葉林、草地和稻田土壤的平均 αox分別為1.017、1.013、1.012、1.015、1.012和1.022，與其他研究結果十分接近（Coleman et al.，1981；Reeburgh et al.，1997；Snover et al.，2000）。

表2 土壤樣品基本理化性質Table 2 The main properties for the soil samples

圖1 不同土壤的CH4氧化氧化潛力(a)以及碳同位素分餾系數αox（b）Fig. 1 CH4 oxidation potential (a) and the carbon isotope fractionation factor αox (b)

詳細來看，不同時段內（甲烷濃度分別降低至初始濃度的 3/4、1/2和 1/4時），αox和 Ψox各有不同（圖1）。原始林、針葉林、混交林、闊葉林和草地Ψox隨培養時間的延長呈上升趨勢，而稻田則依次下降（圖 1a）。分析原因認為，本研究所設計的甲烷濃度，對 5種非稻田土壤來說基本屬于“ 底物豐富”狀態；在長期培養下，土壤氧化菌總體活力（包括數量和氧化能力）上升且受底物濃度的限制較小，因此 Ψox整體上升（圖 1a）。而稻田土壤甲烷氧化菌長期暴露于高濃度甲烷環境，氧化菌總體活力均較高，在活化培養后氧化活力達到很高狀態，因此前期 Ψox很高，后期 Ψox則在甲烷濃度降低的影響下逐漸下降（圖1a）。

相應地，原始林、針葉林、混交林、闊葉林和草地土壤 αox呈先上升后下降趨勢，而稻田土壤則呈下降趨勢（圖1b）。同時，不同土壤αox和Ψox呈高度正相關，在 CH4濃度分別降低至初始濃度的3/4、1/2和 1/4時，兩者的相關系數分別為 0.96（P=0.003）、0.60（P=0.207）和 0.75（P=0.089），平均為0.92（P=0.010）。這與很多研究結果不同（張曉艷等，2016）。一般而言，Ψox越高，CH4氧化菌對底物（12CH4和13CH4）的選擇性則越低（αox下降）。如Templeton et al.（2006）指出細胞數量較低時，αox大于1.030，而細胞數量較高時，αox為1.003。同理，培養溫度升高導致 αox下降的現象也能在一定程度上說明 Ψox與 αox之間的負相關關系（Borjesson et al.，2001；Tyler et al.，1994）。但是，植被類型會對土壤微生物種類和數量產生重要影響（Breulmann et al.，2012；Jangid et al.，2011；Tilman et al.，2001）。在不同植被類型土壤中，CH4氧化菌的種類、活性和親和性可能都存在差別（李超男等，2017；鄧湘雯等，2012）。研究顯示，處于高CH4濃度環境中的CH4氧化菌以及處于低濃度下的 CH4氧化菌分別表現為高親和力（Bender et al.，1992）和低親和力特征（Topp et al.，1997）。據此，本研究稻田土壤屬于低親和類，而其余5種土壤則屬于高親和類。高親和力、低活力的甲烷氧化菌對底物的選擇可能相對較弱，而低親和力、高活力類型氧化菌則對底物選擇相對較強。由此來看，在培養前期，稻田土壤甲烷氧化菌活力高但對甲烷親和力低，因此氧化菌對底物選擇性相對較高，從而表現出較高的 αox；在后期，由于受到底物供給的限制，對底物的選擇性降低，因此表現出較低的 αox。與稻田土壤不同的是，其余 5種土壤雖然甲烷氧化菌親和力高，但前期活力很弱（圖1），對底物選擇性也總體較弱；隨著其活力的增強，對底物選擇性逐漸升高；但在后期，其對底物的選擇也受到底物濃度限制。因此，其 αox表現出先上升后下降的規律（圖1b）。同時，這也是6種土壤αox和Ψox呈正相關關系的主要原因，但其中機制仍需進一步深入研究。

2.3 土壤CH4氧化速率及αox值影響因素分析

不同時段（甲烷濃度分別降低至初始濃度的3/4、1/2和1/4時），土壤 Ψox和 αox與土壤性質的關系如表3所示。可見，Ψox與pH呈負相關（r=-0.51，P=0.298），與活性鋁、活性鐵、活性錳相關性有正有負且基本未達顯著水平，而與 TC（r=0.46，P=0.356）、TN（r=0.74，P=0.093）、NO3--N（r=0.93，P=0.006）、DOC（r=0.96，P=0.002）等呈正相關（表3）。同時，除數值上的差異外，不同時段的相關系數的正負性基本一致（表3），說明Ψox與各影響因素之間的關系是穩定的。土壤Ψox與pH呈負相關主要是因為大多甲烷氧化菌的最適生長 pH范圍為6.6～6.8，而進行甲烷氧化活動的適宜pH范圍也大約為 7.0（Bender et al.，1995；Hanson et al.，1996）。較低pH將對甲烷氧化菌活性產生一定抑制作用。土壤Ψox與TC、TN、DOC等呈正相關，主要因為這些物質存在于土壤有機質中，而土壤有機質含量越高，可能越有利于甲烷氧化菌生存。同時，Ψox與NO3--N和NH4+-N的正相關性，說明氮素對土壤甲烷氧化有促進作用，但這與很多研究不相一致（張曉艷等，2016；Adamsen et al.，1993），如張曉艷等（2016）指出稻田土壤 Ψox與 NO3--N和 NH4+-N呈負相關。但是，NO3-和NH4+對土壤CH4氧化作用的影響，也與甲烷氧化菌類型、氮素種類和數量以及土壤狀況有關（王智平等，2003）。在不同土壤中，氮素的高低或輸入對土壤甲烷氧化的作用可能表現為抑制，也可能表現為促進，也可能無明顯影響（Hutsch et al.，1996；Hutsch et al.，1994；Nesbit et al.，1992；程淑蘭等，2012；Christensen et al.，1997）。因此，本研究所觀測到的氮素對甲烷氧化的促進作用是可能的，且可能與土壤碳積累有關（Borjesson et al.，1998）。另外，αox與土壤性質的相關性與 Ψox基本一致（表3）。可以推測，其主要原因是土壤αox與Ψox存在高度正相關性（r=0.92，P=0.010）。

表3 不同時段土壤CH4氧化速率以及氧化同位素分餾系數與土壤基本性質的關系Table 3 Relationship between CH4 oxidation potential, carbon isotope fractionation factor and soil properties in different periods

3 結論

基于室內好氧培養試驗，研究了滇中高原6種典型植被類型土壤CH4氧化速率Ψox和碳同位素分餾特征及其影響因素。結果表明，不同土壤Ψox有較大差異，稻田、原始林、針葉林、混交林、闊葉林和草地土壤的平均Ψox分別為10.75、3.83、4.39、1.78、3.21 和 0.95 μg·g-1·d-1。相關分析表明，Ψox與活性鋁、活性鐵和活性錳呈弱相關，與pH呈負相關（r=-0.51，P=0.298），而與TC（總碳，r=0.46，P=0.356）、TN（總氮，r=0.74，P=0.093）、NO3--N（硝態氮，r=0.93，P=0.006）、DOC（可溶性有機碳，r=0.96，P=0.002）呈正相關，特別是 NO3-和DOC，相關性達到顯著水平（P=0.006和P=0.002）。說明在這種土壤條件下，pH對甲烷氧化具有抑制作用，而土壤有機質和氮素則有促進作用。同時，稻田、原始林、針葉林、混交林、闊葉林和草地土壤同位素分餾系數αox分別為1.022、1.017、1.013、1.012、1.015和 1.012。土壤 αox與 Ψox呈高度正相關（r=0.92，P=0.010），可能與不同土壤中甲烷氧化菌的甲烷親和力和總體活力有關。

ADAMSEN A P, KING G M. 1993. Methane consumption in temperate and subarctic forest soils: rates, vertical zonation, and responses to water and nitrogen [J]. Applied & Environmental Microbiology, 59(2):485-90.

ASADIEH B, KRAKAUER N Y. 2015. Global trends in extreme precipitation: climate models versus observations [J]. Hydrology and Earth System Sciences, 19(2): 877-891.

BENDER M, CONRAD R. 1992. Kinetics of CH4oxidation in oxic soils exposed to ambient air or high CH4Mixing ratios [J]. FEMS Microbiology Ecology, 101(4): 261-270.

BENDER M, CONRAD R. 1995. Effect of CH4concentrations and soil conditions on the induction of CH4oxidation activity [J]. Soil Biology and Biochemistry, 27(12): 1517-1527.

BORJESSON G, CHANTON J, SVENSSON B H. 2001. Methane oxidation in two Swedish landfill covers measured with carbon-13 to carbon-12 isotope ratios [J]. Journal of Environmental Quality, 30(2): 369-376.

BORJESSON G, NOHRSTEDT H O. 1998. Short- and long-term effects of nitrogen fertilization on methane oxidation in three Swedish forest soils[J]. Biology and Fertility of Soils, 27(2): 113-118.

BREULMANN M, SCHULZ E, WEISSHUHN K, et al. 2012. Impact of the plant community composition on labile soil organic carbon, soil microbial activity and community structure in semi-natural grassland ecosystems of different productivity [J]. Plant and Soil, 352(1-2):253-265.

CHRISTENSEN T R, MICHELSEN A, JONASSON S, et al. 1997. Carbon dioxide and methane exchange of a subarctic heath in response to climate change related environmental manipulations [J]. OIKOS,79(1): 34-44.

COLEMAN D D, RISATTI J B, SCHOELL M. 1981. Fractionation of carbon and hydrogen isotopes by methane-oxidizing bacteria [J].Geochimica et Cosmochimica Acta, 45(7): 1033-1037.

CONRAD R. 2007. Microbial Ecology of methanogens and methanotrophs[J]. Advances in Agronomy, 96: 1-63.

HANSON R S, HANSON T E. 1996. Methanotrophic bacteria [J].Microbiological Reviews, 60(2): 439-471.

HUTSCH B W, RUSSELL P, MENGEL K. 1996. CH4oxidation in two temperate arable soils as affected by nitrate and ammonium application[J]. Biology and Fertility of Soils, 23(1): 86-92.

HUTSCH B W, WEBSTER C P, POWLSON D S. 1994. Methane oxidation in soil as affected by land-use, soil-pH and N-fertilization [J]. Soil Biology and Biochemistry, 26(12): 1613-1622.

IPCC. 2001. Climate change 2001 [R]. Cambridge: Cambridge University Press: 248-251.

IPCC. 2007. Climate Change 2007: The physical science basis. Contribution of working group I to the fourth assessment report of the Intergrovernmental Panel on Climate Change [M]. Cambridge:Cambridge University Press.

ISHIZUKA S, SAKATA T, ISHIZUKA K. 2000. Methane oxidation in Japanese forest soils [J]. Soil Biology and Biochemistry, 32(6):769-777.

JANGID K, WILLIAMS M A, FRANZLUEBBERS A J, et al. 2011.Land-use history has a stronger impact on soil microbial community composition than aboveground vegetation and soil properties [J]. Soil Biology and Biochemistry, 43(10): 2184-2193.

MENYAILO O V, HUNGATE B A. 2003. Interactive effects of tree species and soil moisture on methane consumption [J]. Soil Biology and Biochemistry, 35(4): 625-628.

NESBIT S P, BREITENBECK G A. 1992. A laboratory study of factors influencing methane uptake by soils [J]. Agriculture, Ecosystems &Environment, 41(1): 39-54.

REEBURGH W S, HIRSCH A I, SANSONE F J, et al. 1997. Carbon kinetic isotope effect accompanying microbial oxidation of methane in boreal forest soils [J]. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 61(22): 4761-4767.

SHI X M, DURRAN D R. 2015. Estimating the response of extreme precipitation over midlatitude mountains to global warming [J]. Journal of Climate, 28(10): 4246-4262.

SNOVER A K, QUAY P D. 2000. Hydrogen and carbon kinetic isotope effects during soil uptake of atmospheric methane [J]. Global Biogeochemical Cycles, 14(1): 25-39.

STRIEG R G, MCCONNAUGHEY T A, THORSTENSON D C, et al.1992. Consumption of atmospheric methane by desert soils [J]. Nature,357(6374): 145-147.

TEMPLETON A S, CHU K H, ALVAREZ-COHEN L, et al. 2006. Variable carbon isotope fractionation expressed by aerobic CH4-oxidizing bacteria [J]. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 70(7): 1739-1752.

TILMAN D, REICH P B, KNOPS J, et al. 2001. Diversity and productivity in a long-term grassland experiment [J]. Science, 294(5543): 843-845.TOPP E, PATTEY E. 1997. Soils as sources and sinks for atmospheric methane [J]. Canadian Journal of Soil Science, 77(2): 167-178.

TYLER S C, CRILL P M, BRAILSFORD G W. 1994.13C/12C Fractionation of methane during oxidation in a temperate forested soil [J].Geochimica Et Cosmochimica Acta, 58(6): 1625-1633.

ZHANG G B, YU H Y, FAN X F, et al. 2015. Effect of rice straw application on stable carbon isotopes, methanogenic pathway, and fraction of CH4oxidized in a continuously flooded rice field in winter season [J]. Soil Biology and Biochemistry, 84: 75-82.

程淑蘭, 方華軍, 于貴瑞, 等. 2012. 森林土壤甲烷吸收的主控因子及其對增氮的響應研究進展[J]. 生態學報, 32(15): 4914-4923.

鄧湘雯, 楊晶晶, 陳槐, 等. 2012. 森林土壤氧化 (吸收) 甲烷研究進展[J]. 生態環境學報, 21(3): 577-583.

李超男, 李家寶, 李香真. 2017. 貢嘎山海拔梯度上不同植被類型土壤甲烷氧化菌群落結構及多樣性[J]. 應用生態學報, 28(3): 805-814.

劉惠, 趙平. 2008. 華南丘陵區針葉林和果園地表CH4通量的日變化[J].生態環境學報, 17(3): 1112-1115.

劉實, 王傳寬, 許飛. 2010. 種溫帶森林非生長季土壤二氧化碳、甲烷和氧化亞氮通量[J]. 生態學報, 30(15): 4075-4084.

王智平, 胡春勝, 楊居榮. 2003. 無機氮對土壤甲烷氧化作用的影響[J]應用生態學報, 14(2): 305-309.

張丹丹, 莫柳瑩, 陳新, 等. 2017. 氮沉降對溫帶森林土壤甲烷氧化菌的影響[J]. 生態學報, 37(24): 1-10.

張國盛, 李中杰, 艾銳, 等. 2011. 滇中本地和外來植物群落對紫色土理化性質的影響[J]. 土壤通報, 42(4): 852-858.

張曉艷, 徐華, 馬靜, 等. 2016. 不同地區稻田土壤甲烷氧化碳同位素分餾特征及其影響因素研究[J]. 生態環境學報, 25(6): 927-933.

張穎, 許遠釗, 鄭志興, 等. 2012. 云南化佛山自然保護區大型真菌多樣性及分布特征分析[J]. 植物資源與環境學報, 21(1) : 111-117