白漿土玉米不同生長時期根際土壤細菌和真菌群落碳源代謝特征

朱珂 ，王蕊，李剛*，王晶，修偉明，趙建寧，楊殿林

1. 天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384；2. 農業部環境保護科研監測所，天津 300191

土壤微生物是土壤生態系統最為活躍的組成部分，能夠驅動土壤生態系統的物質和能量轉化、循環和利用，保障土壤生態系統的穩定和正常運轉（Mganga et al.，2016）。土壤細菌和真菌是土壤微生物的主要組成要素，共存于土壤環境中（Frey-Klett et al.，2011），是土壤生態系統中重要的分解者（Sun et al.，2016；Schimann et al.，2017），參與和調控關鍵的生態過程，如有機質的分解、土壤團聚體的形成和穩固等（Boddington et al.，2000；陳志豪等，2017），共同維護土壤生態系統健康。

吉林省和黑龍江省是中國玉米種植面積最大的2個省，2015年的播種面積占中國玉米總播種面積的25.24%，產量占玉米總產量的28.27%（中華人民共和國國家統計局，2016）。白漿土作為吉林省和黑龍江省的重要土壤資源，總面積約為4.18×105hm2，在玉米生產中發揮重要作用（孫元宏等，2017）。白漿土肥力低、酸性強、通透性差和易旱易澇等，被列為區域性低產土壤（賈會彬等，1997）。提升白漿土肥力以保障白漿土資源的可持續利用成為中國東北地區糧食生產亟待解決的問題。目前，關于白漿土的研究集中在機械改土方式優化以及通過秸稈還田改變重組有機碳及團聚體組成、種植綠肥和優化施肥方式提高土壤有機質含量等土壤改良措施的建立（于德清等，1993；匡恩俊等，2008；孟慶英等，2016；孫元宏等，2017），而對耕作白漿土的土壤微生物群落狀況缺乏相關研究。

土壤微生物代謝特征反映土壤微生物群落功能多樣性，與土壤養分元素的循環密切相關（曹永昌等，2016；王文娟等，2017）。本研究擬通過Biolog微平板技術，以中國東北玉米主產區重要的耕作土壤資源——白漿土為研究對象，探討不同生長時期玉米根際土壤細菌和真菌群落功能多樣性變化，從代謝特征的角度分析微生物群落結構的變化規律，豐富白漿土農田微生物的研究內容，為以土壤微生物資源開發和利用為基礎的白漿土質量提升和可持續利用提供理論依據。

1 研究區域與研究方法

1.1 研究區概況

本研究在北京大北農生物技術有限公司吉林省試驗示范基地（125°20′N，43°15′E）進行。該基地位于吉林省四平市伊通滿族自治縣民主村，屬于中溫帶濕潤季風氣候區，年平均氣溫為4.6 ℃，無霜期約為138 d，年平均降雨量為627.8 mm。該地區為長白山脈向松遼平原過渡的丘陵區，其主要土地利用類型為農用坡耕地，以種植玉米為主。供試土壤為白漿土，是吉林省分布面積最大的代表性土壤類型（孫元宏等，2017），也是東北地區重要的土壤資源（孟慶英等，2016）。試驗于2016年進行，在試驗基地中隨機選取長期種植玉米的3個小區（3次重復）進行試驗，小區面積為10 m×15 m，玉米品種為當地主栽品種先玉335。于2016年4月30日播種，種植密度為每畝（1 hm2=15畝）4500株，采取壟溝種植模式，試驗田施復合肥（N-P2O5-K2O：15-15-15），施用量平均為750 kg·hm-2，以基肥形式一次性施入，玉米播種后噴施乙莠合劑封閉處理，全生育期不噴施農藥及不采取其他農事操作。

田間管理措施均按照當地常規操作進行。

1.2 土壤樣品采集

分別于拔節期（6月 28日）、抽雄期（8月 4日）和乳熟期（8月29日）按照十字交叉法，在每個小區選取 5～10株玉米，采用抖落法收集緊緊附著在根上的土壤作為根際土。將每個生長時期同一小區收集到的所有植株的根際土充分混合均勻作為1個樣品，裝入自封袋中，放入低溫樣品儲藏箱中帶回實驗室，共獲得9份土壤樣品（3個生長時期，3次重復）。將土壤樣品過2 mm篩后然后分為兩部分，一部分置于4 ℃冰箱中，用于土壤細菌和真菌群落代謝特征分析；另一部分用于土壤理化性質的測定。

采集土壤樣品時，氣候環境因子情況如下：拔節期周平均氣溫為 25.1 ℃，周平均降水量為 7.4 mm；抽雄期周平均氣溫為 25.3 ℃，周平降水量為86.8 mm；乳熟期周平均氣溫為16.2 ℃，周平均降水量為1.9 mm。

1.3 土壤基本理化性質測定

土壤硝態氮和銨態氮采用連續流動分析儀測定。土壤有機質、速效磷和pH測定方法見鮑士旦（鮑士旦，2008）《土壤農化分析》。基本理化性質的測定結果見表1。

1.4 土壤細菌和真菌群落代謝特征分析

土壤細菌和真菌群落生理代謝圖譜（community level physiological profiling，CLPP）分別使用Biolog-ECO微平板和 Biolog-FF微平板并結合Biolog微生物自動分析儀（Biolog，Hayward，CA，USA）測定。稱取5 g新鮮土壤于無菌三角瓶中，加入0.85%的滅菌NaCl溶液45 mL，封好口后，180 r·min-1振蕩30 min后靜置5 min，取上清液加入滅菌NaCl溶液依次稀釋至10-3。使用八道移液器吸取150 μL稀釋液加到Biolog-Eco和Biolog-FF微平板孔中。Biolog-Eco微平板在 28 ℃下恒溫避光連續培養168 h，每隔24 h讀取590 nm和750 nm波長處的吸光值；Biolog-FF微平板在25 ℃下恒溫避光連續培養168 h，每隔24 h讀取490 nm波長處的吸光值。本研究選取Biolog-Eco和Biolog-FF微平板培養 96 h的吸光值進行微生物群落代謝活性和多樣性指數分析。96 h是是細菌和真菌生長的中間點，介于快速增長期和緩慢增長期之間。。

1.5 數據處理與統計分析

土壤微生物群落整體代謝活性采用平均顏色變化率（AWCD）表征，多樣性采用Shannon指數（H′）、Simpson指數（D）和 McIntosh指數（U）和豐富度指數（S）表征（曹永昌等，2016；鄒春嬌等，2016），計算公式如下：

表1 玉米不同生長時期土壤基本理化性質Table 1 Basic physical-chemical properties of soils in different growth stages of maize

細菌群落代謝活性：

真菌群落代謝活性：

式中，n為培養基碳源的種類數，Biolog-ECO微平板的 n值為 31，Biolog-FF微平板的 n值為95；Ci(590-750)和 Ci(490)分別為細菌和真菌第 i孔的相對吸光值；Ai為第i孔在590 nm處的吸光度值；A0為對照孔在590 nm處的吸光度值；Bi為第i孔在750 nm處的吸光度值；B0為對照孔在750 nm處的吸光度值；Ci為第i孔在490 nm處的吸光值；R為對照孔在490 nm處的吸光值。Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比值；ni是第i孔的相對吸光值，其中細菌為Ci(590-750)，真菌為Ci(490)。

利用SPSS 22.0軟件對不同生長時期土壤微生物群落代謝活性和多樣性指數以及碳源相對利用率進行單因素方差分析（One-way ANOVA），并根據Duncan法進行多重比較；利用CANOCO 4.5.1軟件進行主成分分析（PCA）；利用Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 平均顏色變化率（AWCD)

由圖1A可知，根際土壤細菌的AWCD值隨培養時間延長而逐漸增加，各處理在培養前 24 h增加均比較緩慢；培養24 h后，抽雄期根際土壤細菌的AWCD值急劇增加，而拔節期和乳熟期的AWCD值在培養48 h后才快速升高。根際土壤真菌的AWCD值變化情況與細菌相同（圖1B）。對培養96 h的AWCD值進行分析，發現抽雄期根際土壤細菌的AWCD值最高，拔節期次之，乳熟期最低，抽雄期分別比拔節期和乳熟期高 26.44%和53.37%（P<0.05），拔節期和乳熟期間差異不顯著（P>0.05）（圖1A）。根際土壤真菌的AWCD值變化情況與細菌相同，但 3個時期間均無顯著差異（P>0.05）（圖 1）。

圖1 根際土壤細菌（A）和真菌（B）的AWCD值隨培養時間的變化Fig. 1 Change of average well color development (AWCD) of rhizosphere soil bacteria (A) and fungi (B) over incubation time

表2 不同生長時期根際土壤細菌和真菌群落代謝多樣性指數Table 2 Metabolic diversity index of rhizosphere soil bacterial and fungal community in different growth stages

2.2 根際土壤細菌和真菌群落代謝多樣性指數變化

由表2可知，根際土壤細菌群落的4種多樣性指數隨生長時期的變化表現一致，即抽雄期>拔節期>乳熟期，其中抽雄期的 McIntosh指數顯著高于拔節期和乳熟期（P<0.05），拔節期與乳熟期間差異不顯著（P>0.05），其他3種多樣性指數在不同生長時期間差異均不顯著（P>0.05）。根際土壤真菌群落的 4種多樣性指數隨生長時期的變化趨勢同樣表現為抽雄期>拔節期>乳熟期，但 3個生長時期間均無顯著差異（P>0.05）。根際土壤細菌和真菌群落的 4種多樣性指數變化情況均與AWCD值相似，說明隨著生長時期的推進，根際土壤細菌和真菌群落的多樣性指數均呈現先升高后降低的變化趨勢。

2.3 根際土壤細菌和真菌群落碳源相對利用率變化

由圖 2A可知，3個生長時期根際土壤細菌群落對各類碳源相對利用率最高的是糖類，占總碳源利用率的 35.90%～38.06%，氨基酸類次之，占21.39%～25.77%。對聚合物類、羧酸類、胺類和酚酸類的相對利用率較低，分別占 13.87～18.91%、8.01～9.29%、5.63～10.15%和4.39～6.88%。3個生長時期根際土壤細菌群落對同一碳源的相對利用率間均無顯著差異（P>0.05），但其變化隨生長時期有所不同，對糖類的相對利用率表現為逐漸降低，對羧酸類和氨基酸類的相對利用率表現為先升高后降低，而對聚合物類、酚酸類和胺類的相對利用率表現為先降低后升高。羧酸類為根際土壤真菌群落相對利用率最高的碳源，占總碳源利用率的31.17%～34.90%，糖類次之，占 25.34%～27.77%，而對氨基酸、聚合物類、胺類和其他類的相對利用率分別僅占 18.23%～18.80%、8.07%～10.15%、3.32%～5.85%和6.39%～9.96%（圖2B）。3個生長時期根際土壤真菌群落對糖類、羧酸類和聚合物類的相對利用率表現為先降低后升高，對氨基酸、胺類和其他類的相對利用率表現為先升高后降低。對糖類的相對利用率隨生長時期無顯著變化，氨基酸類和聚合物類的分析結果與糖類相同。抽雄期對胺類和其他類的相對利用率均顯著高于拔節期和乳熟期（P<0.05），拔節期和乳熟期間差異不顯著（P>0.05）。而拔節期對羧酸類的相對利用率最高，顯著高于抽雄期（P<0.05），但與乳熟期無顯著差異（P>0.05）。

2.4 根際土壤細菌和真菌群落代謝特征的主成分分析

采用主成分分析方法分析不同時期根際土壤細菌和真菌群落在碳源利用上的差異。由圖3A可知，拔節期位于第三象限，乳熟期位于第二和第三象限，而抽雄期位于第一和第四象限，說明拔節期與乳熟期根際土壤細菌群落代謝特征存在交集，而抽雄期根際土壤細菌群落代謝特征較拔節期與乳熟期發生了明顯改變。根際土壤真菌群落代謝特征隨生長時期的變化與細菌略有不同，但整體上趨于一致（圖3B）。

3 討論

圖2 不同生長時期根際土壤細菌（A）和真菌（B）群落碳源相對利用率Fig. 2 Relative utilization rate of carbon substrate by rhizosphere soil bacterial and fungal community in different growth stages

圖3 根際土壤細菌（A）和真菌（B）群落代謝特征的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of metabolic characteristics of rhizosphere soil bacterial and fungal community

AWCD值和多樣性指數能夠反映土壤細菌和真菌群落代謝活性、生理狀態與功能（鄒春嬌等，2016；唐海明等，2016）。本研究中，根際土壤細菌的 AWCD值隨生長期的推進而先升高后降低，抽雄期顯著高于拔節期和乳熟期（P<0.05）。分析認為，根際土壤是聯系植物和微生物的紐帶，是植物和微生物相互作用最為活躍的區域（Reinhold-Hurek et al.，2015），植物將多達40%的光合固定碳源以根系分泌物等形式釋放到土壤環境中，為微生物提供了重要的能源物質（Hütsch et al.，2002）。拔節期、抽雄期和乳熟期是玉米的 3個代表性生長時期，玉米根系活動在此期間隨植株生長不斷增強，而進入生殖生長后，植株生長緩慢，根系活動減弱，這種變化導致了細菌活性的相應改變。根際土壤真菌的AWCD值變化與細菌基本一致，說明真菌活性同樣受到生長時期的影響，但其變化并不顯著。Harms et al.（2011）研究認為相比于細菌，真菌對生存環境變化的表現比較穩定，受環境擾動的影響較小。因此，隨玉米生長而產生的根際環境變化對真菌活性沒有造成顯著的影響。土壤微生物多樣性指數反映了微生物群落中物種的豐度及其各類型間的分布，多樣性指數越高，土壤中微生物多樣性越豐富，土壤微生態系統越復雜，功能越穩定（趙蘭鳳等，2017）。本研究中，根際土壤細菌和真菌群落的Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數和豐富度指數變化與AWCD值相同，說明抽雄期根際土壤細菌和真菌活性增強的同時，群落更加穩定。土壤細菌的均勻度顯著升高，而土壤細菌的豐富度、優勢度和利用碳源的數量無顯著變化，土壤真菌的 4項多樣性指標均無顯著變化，這也反映了，雖然根際環境隨生長時期發生改變，但細菌和真菌群落的多樣性整體上未發生明顯變化。

Biolog-Eco微平板上共有31種單一碳源，分為糖類（12種）、氨基酸類（6種）、羧酸類（5種）、聚合物類（4種）、胺類（2種）和酚酸類（2種）等6類（Kong et al.，2006）。Biolog-FF微平板共有95種碳源，分為糖類（44種）、氨基酸類（13種)、羧酸類（17種）、聚合物類（6種）、胺類（6種）和其他類（9種）等6類（Preston-Mafham et al.，2002）。細菌和真菌的代謝功能類群能夠通過對Biolog-Eco和Biolog-FF微平板的6種類型碳源的相對利用程度來反映（張紅等，2014）。本研究中，根際土壤細菌群落主要利用的碳源是糖類和氨基酸類，占總碳源利用的55%以上，這2類碳源屬于易于代謝的高能量底物，最容易被農田土壤細菌所利用（Brackin et al.，2013）。而根際土壤真菌對碳源的利用與細菌有明顯的差別，對羧酸類利用率最高，糖類次之。推測認為玉米根系分泌物組分及微生物對碳源利用的偏好決定了細菌和真菌碳源相對利用率的不同，但具體機理還有待深入研究。同時，本研究結果與胡國彬等（2015）發現小麥和蠶豆間作系統下紅壤根際真菌對糖類的相對利用率最高的結果不同，說明土壤類型、作物種類可能是影響真菌對碳源利用的選擇性的關鍵因素。本研究試驗地白漿土具有典型的酸性強和易干旱等特點，這樣的環境背景決定了真菌利用碳源的種類。根際土壤細菌和真菌群落對不同碳源的相對利用率隨生長時期表現不同，分析認為這一現象與玉米根系環境變化及其與土壤微生物的相互作用有關，土壤微生物群落在適應環境變化的過程中，其對碳源的選擇和利用也發生了相應的改變。同時Biolog微平板中所提供的碳源種類仍然有限，加之土壤細菌和真菌群落對碳源種類利用偏好的不同，也是造成本試驗中不同生長時期根際土壤細菌和真菌群落碳源相對利用率差異的原因之一，但具體情況還有待進一步的研究。

同一種植物在不同生長時期根際微生物群落也會發生變化（Na et al.，2017）。PCA分析發現，抽雄期根際土壤細菌和真菌群落較拔節期與乳熟期發生了明顯改變，而拔節期與乳熟期比較相似。抽雄期是玉米由營養生長向生殖生長過渡的時期，葉面積指數等生理指標均達到最高值，新陳代謝旺盛，根系活動及與微生物的相互作用也最為強烈，推測認為這些變化直接導致了根際土壤微生物群落結構的改變，而拔節期和乳熟期時，對根際微生物的影響相對較小，這2個時期土壤微生物群落結構雖有所不同，但差異并不明顯。

本研究采用 Biolog微平板技術同時對玉米根際土壤細菌和真菌代謝特征隨生長時期的變化進行了分析，為掌握白漿土微生物群落情況提供了基礎數據，但僅從微生物代謝特征信息得到群落結構變化的詳細信息仍比較局限，今后將采用更先進的分析方法，如宏基因組技術、宏轉錄組技術等，并結合更為豐富的試驗設計，為中國白漿土資源的可持續利用提供技術支撐。

4 結論

（1）根際土壤細菌和真菌活性呈先升高后降低的變化趨勢。抽雄期細菌活性分別比拔節期和乳熟期高26.44%和53.37%，差異顯著，真菌活性無顯著變化。

（2）根際土壤細菌和真菌的多樣性指數變化均表現為抽雄期>拔節期>乳熟期，僅抽雄期細菌的McIntosh指數顯著高于拔節期和乳熟期。

（3）糖類（35.90%～38.06%）和氨基酸類（21.39%～25.77%）是細菌群落相對利用率最高的碳源，而真菌群落相對利用率最高的碳源為羧酸類（31.17%～34.90%）和糖類（25.34%～27.77%）。根際土壤細菌和真菌對不同碳源的相對利用率隨生長時期變化而不同。

（4）拔節期和乳熟期根際土壤細菌群落代謝特征相似，且均與抽雄期明顯不同，真菌群落代謝特征變化與細菌相似。

致謝：感謝北京大北農生物技術有限公司吉林省試驗示范基地員工在實驗中給予的幫助。

BODDINGTON C L, DODD J C. 2000. The effect of agricultural practices on the development of indigenous arbuscular mycorrhizal fungi. II.Studies in experimental microcosms [J]. Plant and Soil, 218(1-2):145-157.

BRACKIN R, ROBINSON N, LAKASHMANAN P, et al. 2013. Microbial function in adjacent subtropical forest and agricultural soil [J]. Soil Biology and Biochemistry, 57(3): 68-77.

FREY-KLETT P, BURLINSON P, DEVEAU A, et al. 2011.Bacterial-fungal interactions: hyphens between agricultural, clinical,environmental, and food microbiologists [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 75(4): 583-609.

HARMS H, SCHLOSSER D, WICK L Y. 2011. Untapped potential:exploiting fungi in bioremediation of hazardous chemicals [J]. Nature Reviews Microbiology, 9(3): 177-192.

HüTSCH B W, AUGUSTIN J, MERBACH W. 2002. Plant rhizodepositionan important source for carbon turn over in soils [J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 165(4): 397-407.

KONG W D, ZHU Y G, FU B J, et al. 2006. The veterinary antibiotic oxytetracycline and Cu influence functional diversity of the soil microbial community [J]. Environmental Pollution, 143(1): 129-137.

MGANGA K Z, RAZAVI B S, KUZYAKOV Y. 2016. Land use affects soil biochemical properties in Mt. Kilimanjaro region [J]. Catena, 141:22-29.

NA X F, XU T T, LI M, et al. 2017. Bacterial diversity in the rhizosphere of two phylogenetically closely related plant species across environmental gradients [J]. Journal of Soils and Sediments, 17(1): 122-132.

PRESTON-MAFHAM J, BODDY L, RANDERSON P F. 2002. Analysis of microbial community functional diversity using sole-carbon-source utilization profiles-a critique [J]. FEMS Microbiology Ecology, 42(1):1-14.

REINHOLD-HUREK B, BUNGER W, BURBANO C S, et al. 2015. Roots shaping their microbiome: global hotspots for microbial activity [J].Annual Review of Phytopathology, 53: 403-424.

SCHIMANN H, BACH C, LENGELLE J, et al. 2017. Diversity and structure of fungal communities in neotropical rainforest soils: the effect of host recurrence [J]. Microbial Ecology, 73(2): 310-320.

SUN R B, DSOUZA M, GILBERT J A, et al. 2016. Fungal community composition in soils subjected to long-term chemical fertilization is most influenced by the type of organic matter [J]. Environmental Microbiology, 18(12): 5137-5150.

鮑士旦. 2008. 土壤農化分析[M]. 第三版. 北京: 中國農業出版社.

曹永昌, 譚向平, 和文祥, 等. 2016. 秦嶺地區不同林分土壤微生物群落代謝特征[J]. 生態學報, 36(10): 2978-2986.

陳志豪, 梁雪, 李永春, 等. 2017. 不同施肥模式對雷竹林土壤真菌群落特征的影響[J]. 應用生態學報, 28(4): 1168-1176.

胡國彬, 董坤, 董艷, 等. 2015. 小麥與蠶豆間作對根際真菌代謝功能多樣性的影響[J]. 土壤學報, 52(4): 926-933.

賈會彬, 劉峰, 趙德林, 等. 1997. 白漿土某些理化特性與改良的研究[J]. 土壤學報, 34(2): 130-137.

匡恩俊, 劉峰, 賈會彬, 等. 2008. 心土培肥改良白漿土的研究Ⅰ白漿土心土培肥的效果[J]. 土壤通報, 39(5): 1160-1109.

孟慶英, 張春峰, 賈會彬, 等. 2016. 不同機械改土方式對白漿土物理特性及酶活性的影響[J]. 土壤學報, 53(2): 552-559.

孫元宏, 高雪瑩, 趙興敏, 等. 2017. 添加玉米秸稈對白漿土重組有機碳及團聚體組成的影響[J]. 土壤學報, 54(4): 1009-1017.

唐海明, 肖小平, 李微艷, 等. 2016. 長期施肥對雙季稻田根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 生態環境學報, 25(3): 402-408.

王文娟, 李景文, 王中斌, 等. 2017. 胡楊根際土壤真菌群落代謝特征及其土壤影響因子研究[J].. 西北植物學報, 37(7): 1429-1437.

于德清, 丁慶堂, 關熙銘, 等. 1993. 種植牧草在白漿土改良中的作用[J]. 應用生態學報, 4(1): 37-41.

張紅, 呂家瓏, 曹瑩菲, 等. 2014. 不同植物秸稈腐解特性與土壤微生物功能多樣性研究[J]. 土壤學報, 51(4): 743-752.

趙蘭鳳, 張新明, 程根, 等. 2017. 生物炭對菜園土壤微生物功能多樣性的影響[J]. 生態學報, 37(14): 4754-4762.

中華人民共和國國家統計局. 2016. 中國統計年鑒2016[M]. 北京: 中國統計出版社.

鄒春嬌, 齊明芳, 馬建, 等. 2016. Biolog-ECO解析黃瓜連作營養基質中微生物群落結構多樣性特征[J]. 中國農業科學, 49(5): 942-951.