miR-146a和miR-185對惡性胸腔積液的診斷價值

鄭丹丹， 錢粉紅， 鄧霞， 莊瓊馨， 柳星星

(江蘇大學附屬醫院呼吸內科， 江蘇 鎮江 212001)

惡性胸腔積液是由腫瘤侵襲胸膜后導致人體胸膜腔內液體異常增多所致?；颊叱霈F惡性胸腔積液提示腫瘤已發生遠處轉移，屬于腫瘤晚期，預后往往較差。因此，臨床上對惡性胸腔積液的早期診斷尤為重要。胸腔積液穿刺檢查不僅可緩解患者呼吸困難，還可進行胸腔積液的細胞病理學檢查以及胸膜活檢，而后兩種病理學檢查是診斷惡性胸腔積液的金標準，但陽性率偏低[1-2]。胸腔積液腫瘤標志物如癌胚抗原雖有較高的特異性，但診斷的敏感性往往欠佳[1]。因此，尋找一種無創、準確率高、操作方便、費用低、并發癥少的鑒別胸腔積液良惡性的方法是目前臨床上急需解決的難題。

現發現在多種疾病中，患者的痰液、關節液、腦脊液、血液等體液中存在一些種類miRNA的差異表達[3-7]，這些miRNA有可能成為診斷的特異性標志物。本研究擬選用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測惡性胸腔積液和良性胸腔積液中miR-146a、miR-185的相對表達量，并構建受試者工作特征曲線(ROC)，評價這兩種miRNA用于鑒別診斷惡性胸腔積液的臨床效能。

1 對象與方法

1.1 病例和標本

收集2016年2月到2017年12月在本院診斷為胸腔積液病例的胸腔積液標本共81份。標本的納入標準：胸腔積液病因診斷明確，并且為初診初治患者，均未經抗結核治療、化療、放療、分子靶向、生物免疫治療。標本中包括惡性胸腔積液40例，均經細胞組織病理學證實，其中肺腺癌34例，肺鱗癌2例，小細胞肺癌4例,年齡中位數為65.00歲；良性胸腔積液41例，其中結核性胸腔積液24例，類肺炎性胸腔積液12例，漏出性胸腔積液5例，年齡中位數為56.61歲。良、惡性胸腔積液患者的年齡、性別分布間差異無統計學意義(P>0.05，表1)。標本采集前均告知患者相關并發癥風險并經患者知情同意。

表1 兩組胸腔積液患者的年齡和性別分布 例

1.2 標本收集

常規B超定位胸腔積液后對患者行胸腔穿刺術，用含有枸櫞酸鈉抗凝劑的50 mL無菌離心管收集200 mL的胸腔積液，充分搖勻后，立即置于4 ℃，1 500 r/min離心20 min。離心后棄上清液，采用紅細胞裂解液裂解胸腔積液沉淀物中的紅細胞，吹打混勻后置于4 ℃的離心機中，500 r/min離心5 min。離心后去上清液，用PBS液沖洗沉積物2次，離心后在沉積物中加Trizol液，吹打混勻后置于-70 ℃的冰箱凍存。同時收集患者胸腔積液中癌胚抗原及CYFRA 21-1的檢測值資料。

1.3 RT-PCR檢測胸腔積液中miR-146a和miR-185的表達

1.3.1 RNA提取 采用Trizol法(廣州銳博生物有限公司提供試劑)提取胸腔積液沉淀物的總RNA，使用U-2800 紫外分光光度儀測定其濃度及純度，置超低溫冰箱(-70 ℃) 儲存備用。

1.3.2 反轉錄合成cDNA 使用日本TaKaRa公司提供的反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent(RR037A)，由廣州銳博公司提供引物，并按照該公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的操作說明反轉錄合成cDNA。隨后的操作均在冰上完成：取2μg的總RNA，分別加入2μL miR-185、miR-146a、U6的反轉錄引物工作液，加DEPC水至11μL，放置PCR機70 ℃10 min后冰上孵育2 min；隨后加5×PrimeScript緩沖液7μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL,加DEPC水至25μL體系，放置于PCR機42 ℃60 min，70 ℃10 min一個循環后立即取出，冰上孵育2 min，最后置-20℃冰箱儲存備用。

1.3.3 RT-PCR 使用日本TaKaRa公司提供的實時熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix EX TaqTM(RR420A)，由廣州銳博提供引物，并按照銳博公司提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Primer的說明書操作。隨后實驗操作均在冰上完成：取2 μL cDNA，加入9 μL SYBR、0.4 μL ROX，前引物和后引物各0.8 μL，最后加DEPC水至20 μL，置于熒光定量PCR儀Mx3000p 95 ℃ 20 s 1個循環；95 ℃10 s，60 ℃20 s 40個循環；95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s 1個循環。計算機自動輸出標本的擴增、熔解曲線、CT值。采用2-△Ct計算胸腔積液中miR-185、miR-146a的相對表達量。

1.4 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件分析實驗數據。檢測值均符合非正態分布，因此選用中位數表示計量資料。選用Mann-WhitneyU秩和檢驗對兩獨立樣本行非參數檢驗。繪制ROC曲線評估miR-146a、miR-185對惡性胸腔積液的診斷價值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 良惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，miRNA-146a、miRNA-185在惡性胸腔積液中的表達均明顯低于良性胸腔積液(P均<0.01)。臨床資料也顯示良、惡性胸腔積液中的癌胚抗原和CYFRA 21-1濃度間的差異亦有統計學意義(P均<0.01)。見表2。

表2 4種標志物在胸腔積液中的檢測值 中位數(范圍)

2.2 miR-146a及miR-185在惡性胸腔積液中的表達水平與臨床參數的相關性

統計分析顯示，在惡性胸腔積液中miR-146a及miR-185的表達水平與患者的年齡、性別、吸煙史、病理分型均無明顯相關性(P≥0.05)。見表3。

表3 惡性胸腔積液miR-146a及miR-185表達水平與臨床參數的相關性 中位數(范圍)

2.3 miR-146a、miR-185與癌胚抗原、CYFRA 21-1在良惡性胸腔積液中診斷價值的比較

ROC曲線顯示，miR-146a和miR-185的曲線下面積(AUC)均低于癌胚抗原，但高于CYFRA21-1。miR-146a診斷的敏感度均高于癌胚抗原及CYFRA 21-1，miR-185診斷的敏感性高于CYFRA 21-1，但低于癌胚抗原，而特異性均低于癌胚抗原和CYFRA 21-1。miR-146a、miR-185聯合診斷的AUC與單獨診斷的AUC相比并無明顯提高，取最佳臨界值為1 856，其敏感性低于單獨診斷，而特異性高于miR-146a，但低于miR-185。聯合癌胚抗原能進一步提高兩類miRNA診斷惡性胸腔積液的AUC。但兩種miRNAs共同聯合癌胚抗原診斷惡性胸腔積液的AUC較任一種miRNA聯合癌胚抗原無明顯上升。見圖1、表4。

圖1 胸腔積液中各檢測標記物診斷的ROC曲線

表4 各種標志物在胸腔積液中的診斷效能評價

3 討論

本研究結果顯示在良、惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185表達水平的差異具有統計學意義。ROC曲線顯示惡性胸腔積液中miR-146a、miR-185的診斷敏感性均高于經典的腫瘤標志物癌胚抗原、CYFRA 21-1，但兩種miRNAs的特異度均低于癌胚抗原、CYFRA 21-1。兩種miRNAs中任一種聯合癌胚抗原或兩種miRNAs共同聯合癌胚抗原均能進一步提高對惡性胸腔積液的診斷效能。

Xie等[8-9]利用定量RT-PCR技術于2010年首次發現惡性胸腔積液中miR-24、miR-30d的表達量較良性胸腔積液上調。隨后，國內外多項研究均顯示miRNAs在良、惡性胸腔積液中存在差異性表達[10-12]。Shin等[13]發現惡性胸腔積液中miR-185的表達水平低于良性胸腔積液，并與臨床上常用的腫瘤標志物癌胚抗原進行比較，發現癌胚抗原與miRNA聯合應用可提高惡性胸腔積液的診斷效能。該研究結果與本研究結果一致。本實驗還發現miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中的表達與患者年齡、性別、吸煙史及臨床分型無明顯相關性。因此，miR-146a、miR-185有望成為鑒別診斷惡性胸腔積液的腫瘤標志物。

miRNAs的異常表達可發生在多種類型的惡性腫瘤中，其可作用于癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生發展。Wang等[14]研究表明miR-146a在非小細胞肺癌的組織和細胞中均表達較低，充當抑癌基因的作用。該研究發現通過增加miR-146a的表達可以靶向抑制巨噬細胞游走抑制因子的表達水平。實驗表明miR-146a經NF-kB信號途徑實現抑制腫瘤的增殖并發揮了誘導肺癌細胞凋亡的作用。在胃癌、前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤中miR-146a顯示出抑癌基因的作用[15-17]。Li等[18]發現在肺癌細胞中miR-185的表達顯著下調，miRNA-185通過靶向AKT1調節肺癌細胞增殖、遷移和侵襲以及體內腫瘤生長。Qiu等[19]的研究表明胃癌中miR-185呈低表達，其通過調控靶基因TRIM29參與胃癌的形成與發展。Zou等[20]的研究表明miR-185在乳腺癌細胞中低表達，Raf-1激酶抑制蛋白通過上調靶向高遷移率組AT-hook 2的miR-185來抑制腫瘤的增殖和轉移。綜上，miR-146a、miR-185可通過靶向目的基因參與調控多種腫瘤的增殖、遷移和侵襲，在腫瘤的發生發展中起重要作用。但目前惡性胸腔積液的形成機制尚不明確，miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中低表達的具體機制仍需進一步的研究。

綜上，本研究表明，與良性胸腔積液相比，miR-146a、miR-185在惡性胸腔積液中顯著低表達。雖然，國內外多項研究發現miRNA在胸腔積液中存在差異性表達[10-12]，但是對同一種miRNA的研究相對較少，即miRNA的重復性仍需要后續研究的驗證。本研究雖然顯示miR-146a、miR-185有望作為鑒別惡性胸腔積液的非侵入性的標志物，但是臨床惡性胸腔積液的確診仍需要病理學證據。另外，本研究的樣本量偏少也可能對實驗結果產生偏移，需要大樣本進一步驗證。

[ 1 ] Na MJ. Diagnostic tools of pleural effusion [J]. Tuberc Respir Dis, 2014, 76(5):199-210.

[ 2 ] Dixon G, de Fonseka D, Maskell N.Pleural controversies:image guided biopsy vs. thoracoscopy for undiagnosed pleural effusions?[J]. J Thorac Dis, 2015, 7(6):1041-1051.

[ 3 ] Sheervalilou R, Ansarin K, Fekri Aval S, et al. An update on sputum microRNAs in lung cancer diagnosis[J]. Diagn Cytopathol, 2016, 44(5):442-449.

[ 4 ] Kolhe R, Hunter M, Liu S, et al. Gender-specific differential expression of exosomal miRNA in synovial fluid of patients with osteoarthritis[J]. Sci Rep, 2017, 7(1):2029.

[ 5 ] Müller M, Kuiperij HB, Versleijen AA, et al. Validation of microRNAs in cerebrospinal fluid as biomarkers for different forms of dementia in a multicenter study[J].J Alzheimers Dis,2016, 52(4):1321-1333.

[ 6 ] Pospisilova S, Pazourkova E, Horinek A, et al. MicroRNAs in urine supernatant as potential non-invasive markers for bladder cancer detection[J]. Neoplasma, 2016, 63(5):799-808.

[ 7 ] Huang Y, Hu Q, Deng Z, et al. MicroRNAs in body fluids as biomarkers for non-small cell lung cancer: a systematic review [J]. Technol Cancer Res Treat, 2013, 13(3):277-287.

[ 8 ] Xie L,Wang T, Yu S, et al. Cell-free miR-24 and miR-30d, potential diagnostic biomarkers in malignant effusions[J]. Clin Biochem, 2010, 44(2/3):216-220.

[ 9 ] Xie L, Chen X, Wang L, et al. Cell-free miRNAs may indicate diagnosis and docetaxel sensitivity of tumor cells in malignant effusions[J]. BMC Cancer, 2010, 10:591.

[10] Han HS, Yun J, Lim SN, et al. Downregulation of cell-free miR-198 as a diagnostic biomarker for lung adenocarcinoma-associated malignant pleural effusion[J].Int J Cancerl,2013,133(3): 645-653.

[11] Cappellesso R,Nicolè L,Caroccia B,et al.Young investigator challenge:MicroRNA-21/MicroRNA-126 profiling as a novel tool for the diagnosis of malignant mesothelioma in pleural effusion cytology[J]. Cancer Cytopathol, 2016, 124(1):28-37.

[12] Qian Q, Sun W, Zhu W, et al. The role of microRNA-93 regulating angiopoietin2 in the formation of malignant pleural effusion[J]. Cancer Med, 2017, 6(5):1036-1048.

[13] Shin YM, Yun J, Lee OJ, et al. Diagnostic value of circulating extracellular miR-134, miR-185, and miR-22 levels in lung adenocarcinoma-associated malignant pleural effusion[J]. Cancer Res Treat, 2014, 46(2):178-185.

[14] Wang WM, Liu JC. Effect and molecular mechanism of

mir-146a on proliferation of lung cancer cells by targeting and regulating MIF gene[J]. Asian Pac J Trop, 2016, 9(8):806-811.

[15] Chen YM, Zhou B, Xu LB, et al. MicroRNA-146a promotes gastric cancer cell apoptosis by targeting transforming growth factor β-activated kinase 1[J]. Mol Med Rep, 2017, 16(1): 755-763.

[16] Huang Y, Tao T, Liu C, et al. Upregulation of miR-146a by YY1 depletion correlates with delayed progression of prostate cancer[J]. Int J Oncol, 2017, 50(2):421-431.

[17] Stückrath I, Rack B, Janni W, et al. Aberrant plasma levels of circulating miR-16, miR-107, miR-130a and miR-146a are associated with lymph node metastasis and receptor status of breast cancer patients[J]. Oncotarget, 2015, 6(15):13387-13401.

[18] Li S, Ma Y, Hou X, et al. MiR-185 acts as a tumor suppressor by targeting AKT1 in non-small cell lung cancer cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9):11854-11862.

[19] Qiu F, Xiong JP, Deng J, et al. TRIM29 functions as an oncogene in gastric cancer and is regulated by miR-185[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(5):5053-5061.

[20] Zou Q, Wu H, Fu F, et al. RKIP suppresses the proliferation and metastasis of breast cancer cell lines through up-regulation of miR-185 targeting HMGA2[J]. Arch Biochem Biophys, 2016, 610:25-32.