懷山藥內生真菌的分離與鑒定

文春南 王曉龍 李守婷 張朋展 葉穎曉 麻兵繼

摘要：以懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）為試驗材料，采用組織塊分離法和研磨分離法對懷山藥根莖中內生真菌進行分離，并運用形態學及分子生物學方法對其進行鑒定。結果表明，共分離得到23株真菌，經鑒定分別為鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、地霉菌屬（Geotrichum）、彎孢菌屬（Curvularia）和鏈格孢屬（Alternaria）等6個屬。

關鍵詞：懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）；內生真菌；分子生物學方法；鐮孢菌

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0058-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.015

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Dioscorea opposita Thunb

WEN Chun-nan，WANG Xiao-long，LI Shou-ting，ZHANG Peng-zhan，YE Ying-xiao，MA Bing-ji

（College of Agronomy，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The rhizome of Dioscorea opposita Thunb was used as the experimental material，and then endophytic fungi were isolated by the methods of tissue and grinding separation. The isolated strains were then identified by morphology and molecular biology approaches. The results showed that 23 strains from D. opposita Thunb were identified，which belonged to 6 genera，namely，Fusarium，Penicillium，Aspergillus，Geotrichum，Curvularia and Alternaria.

Key words： Dioscorea opposita Thunb； endophytic fungi； molecular biology approaches； Fusarium

懷山藥（Dioscorea opposita Thunb）為薯蕷科多年生植物薯蕷的根狀莖，自古以來即是河南省著名的“四大懷藥”之一，具有健脾胃、益肺腎、止痢疾、化痰涎等功效，又被稱為“懷參”[1]。藥典收載的懷山藥的藥材生產具有明顯的地域性，即河南懷慶府（古懷慶府即今河南省焦作一帶，含博愛、武陟、沁陽、溫縣等地）為主要產地[2]。鑒于懷山藥具有藥食兼用的功效且口感好，國內外市場對懷山藥的需求量巨大。當前對懷山藥的文獻研究多集中于藥材人工栽培及其生物功能等方面，而人工栽培的研究又主要集中在懷山藥的外部生長環境研究，即氣候因子、光照、溫度、土壤、水分等[3，4]，對懷山藥植株內環境如內生真菌的研究較少。植物內生真菌是指那些在其生活史中某一段時期生活在活的植物組織內，對宿主植物組織不引起明顯病害癥狀的真菌[5]。雖然中藥材內生真菌和藥材質量之間存在密切聯系，是藥材道地性形成的關鍵因子之一，相關研究文獻也較多[6，7]。但懷山藥內生真菌與藥材品質之間的關聯性尚缺乏研究。因此，本研究從懷山藥的內生真菌分離鑒定著手，分析懷山藥內生真菌的多樣性，為今后系統研究內生真菌與懷山藥品質及道地性之間的關系提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 供試植株樣品為河南省焦作市溫縣農科所懷山藥試驗基地采集的健壯懷山藥植株，品種為鐵棍山藥。

1.1.2 分離純化培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g、去離子水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 內生真菌的分離和純化 將懷山藥切成小段，取懷山藥一小段根用無菌水反復清洗至樣品表面徹底干凈，再依次用75%乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸取表面多余水分，并以最后一次沖洗過的無菌水200 μL涂布于PDA培養基平板上作為空白對照，以檢測樣品表面的滅菌效果[8]。放入培養箱中繼續培養5～15 d，觀察培養皿中材料切口處長出菌絲（菌落），待菌落出現后，根據菌落形態、顏色的差異以及出現新菌時間的不同，分別用無菌牙簽挑取各平板菌落邊緣的菌絲轉接于新的空白PDA培養基上，按上述培養條件繼續培養2～3代，以確保純化獲得單一菌株。

1.2.2 內生真菌形態學鑒定 參考文獻[9]，根據純化得到的真菌菌落培養特征、菌絲形態、產孢結構類型以及孢子的形態、顏色、大小進行初步分類鑒定。

1.2.3 內生真菌分子鑒定 內生真菌DNA提取：參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進行操作，得DNA溶液，于-20 ℃冰箱中保存、備用。

rDNA-ITS的PCR擴增反應體系，Premix Taq 25 μL，ITS1（20 μmol/L）2 μL，ITS4（20 μmol/L）2 μL，ddH2O 19 μL，DNA模版2 μL，上游引物ITS1：5′-TC

CGTAGGTGAACCTGCGG-3′；下游引物ITS4：5′-TC

CTCCGCTTATTGAATGC-3′。PCR反應體系50 μL。

PCR擴增程序（每份擴增產物平行3份）：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，1 min，復性49 ℃，1 min，延伸72 ℃，2 min，30個循環；延伸72 ℃，10 min；4 ℃ 10 min。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，1×TAE電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，EB染色5 min，由凝膠成像系統進行觀察、拍照。檢測后置于-20 ℃冰箱中保存、備用。

內生真菌rDNA基因的系統發育分析：將PCR擴增產物交由華大基因科技有限公司進行測序，測序結果與GenBank數據庫中的已知序列進行NCBI BLAST比對分析，采用分子進化遺傳分析軟件MEGA ver. 5.0構建系統發育樹。其中系統進化矩陣按Kimura 2-Parameter模型估算，采用鄰接法（Neighbor-Joining）聚類分析構建系統發育樹，重復取樣 1 000次進行自展值（Bootstrap value）分析，評估系統進化樹拓撲結構的穩定性。定義16S rDNA序列相似性大于98%為同一個物種[10]。

2 結果與分析

2.1 內生真菌分離

通過組織分離法從懷山藥根中共分離得到23株真菌，經鑒定為6個屬，分別為鐮孢菌屬（Fusarium）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、地霉菌屬（Geotrichum）、彎孢菌屬（Curvularia）和鏈格孢屬（Alternaria）。

2.2 形態學鑒定

將分離得到的內生真菌依次進行菌落特征和顯微觀察。如菌株Doef-1，菌絲茂密豐富，棉絮狀，白色至乳黃色；有大量分生孢子，鍥形至梭狀鐮刀形；隔膜明顯，多數為3個隔膜，少量有4～6個隔膜；厚垣孢子生于分生孢子梗或菌絲短枝的頂端，球形至卵形。按照魏景超[9]的方法初步認為菌株Doef-1為鐮刀菌屬（Fusarium）真菌。

2.3 分子學鑒定

2.3.1 PCR擴增產物凝膠電泳結果 對分離得到的內生真菌提取DNA，然后進行rDNA-ITS序列擴增，在550 bp處出現一條單一明亮的條帶，條帶大小與預期目標一致。

2.3.2 rDNA-ITS序列比對以及系統發育樹的構建 進一步測序結果顯示23個菌株的rDNA-ITS片段大小為500～550 bp，將所獲得的內生菌rDNA-ITS片段與NCBI中已知序列進行Blast比對，結果見表1。

對比分離得到的23株內生真菌與其同源性相似的已知16S DNA序列，挑取相似性在97%以上的菌株，利用MEGA 5.0和Clustal X軟件構建系統發育樹，結果見圖1。

由表1及圖1可知，糞殼菌綱為優勢類群，占內生真菌總數的40%，分離得到的9個菌株（Doef-1、Doef-2、Doef-5、Doef-8、Doef-10、Doef-14、Doef-18、Doeb-19、Doef-20）分屬糞殼菌綱的1個屬（Fusarium）；7個菌株（Doef-3、Doef-4、Doef-6、Doef-7、Doef-9、Doef-12、Doef-16）分屬散囊菌綱的2個屬（Aspergillus、Penicillium）；6個菌株（Doef-11、Doef-13、Doef-17、Doef-21、Doef-22、Doef-23）為座囊菌綱的2個屬（Curvularia、Alternaria）；半子囊菌綱則分離得到1個屬（Geotrichum）的1個菌株（Doeb-4）。其中內生真菌主要分布在鐮孢菌屬（Fusarium），為懷山藥內生真菌中優勢菌群。

3 小結與討論

本試驗分離得到23株真菌，經鑒定為6個屬。張志東等[11]從山藥根中分離到10株內生細菌并鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）和歐文氏菌屬（Erwinia），沒有分離到內生真菌，這可能與所選用的山藥品種不同有關。張建新等[12]用涂布平板法從鐵棍山藥分離到32株內生菌，有4株真菌，28株細菌，其中篩選到了11株內生細菌對白菜軟腐菌有拮抗作用，但沒有對這些內生菌鑒定到屬。與上述文獻報道不同，本試驗所用懷山藥樣品采于河南省焦作市溫縣（懷山藥產地之一），不同于市售山藥，因而分離到的內生真菌種類較多。

懷山藥道地性的形成非常復雜，其道地性的科學機制闡明必然是一個復雜的系統研究。本試驗作為懷山藥道地性系統研究的一部分，研究結果豐富了懷山藥內生真菌的種類和資源，填補了懷山藥內生真菌研究的空白。為今后進一步研究內生真菌與懷山藥道地性之間的關聯作用，如內生菌是否具有促進藥材生長發育、增強藥材抗逆性及促進懷山藥藥材有效成分積累等作用的研究提供參考。

參考文獻：

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