青海極端生境植物根圍促生菌分離鑒定及生物活性分析

吳曉暉 謝永麗 梁欣 張英 蘆光新

摘要：通過平板對峙試驗以分離篩選自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗場3個極端生境植被根圍的菌株為供試菌株，進行拮抗活性檢測；采用16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株；采用CMC法及Gram染色法測定菌株降解纖維素活性；對具降解纖維素活性的拮抗菌株進行促生活性測定。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5分別對油菜菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麥長孢蠕菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）具有拮抗活性，抑菌圈平均直徑均>20 mm。3株菌株均被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均具降解纖維素及促植物生長活性。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；分子鑒定；降解纖維素活性；拮抗活性；促生

中圖分類號：Q948.12+2.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0061-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.016

Isolation and Identification of Growth-promoting Rhizosphere Strains Isolated from Extreme Environment and Its Biological Activity Analysis

WU Xiao-hui，XIE Yong-li，LIANG Xin，ZHANG Ying，LU Guang-xin

（College of Agricultural and Animal Husbandry，Qinghai University/Key Laboratory of Altiplano Grassland Resource and Ecology，Province and Education Ministry，Xining 810016，China）

Abstract： The strains were isolated from three representative extreme sample area including Tuogeruoge semi-desert sand，Tuosu Lake salt and alkali land，detonation test site of Haibei in Qinghai province. Antagonistic activity detection was used to check antagonistic activity of these strains. Polyphasic molecular taxonomy methods including gyrB and 16S rDNA partial sequence analysis were used to identify these strains. The CMC plate test and Gram staining method were used to analysis cellulose degradation of the bio-control strains. The results showed that three strains including TGRG3，TGRG7 and TSH5 could present distinct antagonistic activity to Sclerotinia sclerotiorum，Fusarium graminearum and Helminthotporium tritici-vulgaris，and diameters of the inhibition zone were all longer than 20 mm. The strains of TGRG3，TGRG7 and TSH5 were identified as Bacillus subtilis. All of three biocontrol B. subtilis strains had cellulose-degradation activity and promotion function on growth of plant.

Key words： Bacillus subtilis； molecular identification； cellulose-degradation activity； antagonistic activity； growth-promoting

芽孢桿菌（Bacillus spp.）革蘭氏陽性細菌，好氧或兼性厭氧，能產生耐熱、耐鹽堿、耐紫外等內源芽孢，環境適應性強，分布于各種環境中，在農牧業、工業和醫學研究等方面扮演著極其重要的角色[1]。芽孢桿菌作為根圍促生菌（Plant Growth-promoting Rhizobacteria，PGPR），其促生機制包括提高植物根際營養的可利用性，促進難溶性磷、鐵和微量元素的吸收；產生植物激素類物質有赤霉素（Gibberellins）、吲哚-3-乙酸（IAA）、細胞分裂素（Cytokinin）等。此外，還可通過抑制病原物、誘導植物抗病性來間接促進植物生長[2]。部分芽孢桿菌能夠固氮、溶磷，對土壤有機質進行分解，從而提高土壤肥力，促進土壤營養元素循環；部分芽孢桿菌能產生胞外纖維素酶、半纖維素酶等，能夠有效降解木質纖維素[3，4]。芽孢桿菌是當前研究應用較廣的一類微生物資源。

草場是以土壤-牧草-家畜為主體形成的生態系統，在該系統中，微生物對土壤、牧草和家畜都起著至關重要的作用[5]。青海省地域環境特殊，秋冬季節草場枯黃，飼料來源緊張，若將能產生降解木質纖維素酶類的生防芽孢桿菌菌源應用于飼料加工生產，通過芽孢桿菌分泌的高效纖維素降解酶加速草料降解，使草料養分有效釋放，提高牲畜對營養的消化吸收效率，是畜牧業發展的有效途徑[6]。

青海省為“三江之源”，是重要的農牧業大省，特殊生境決定其生態環境保護的差異性。因此，減少化學農藥的使用，可降低其對人類健康、生態環境及糧食安全構成的嚴重威脅，而開發綠色天然、對環境友好的生物菌肥應用于生態環境保護、植被退化恢復，顯得尤為重要[6]。芽孢桿菌抗菌防病機制主要包括拮抗與競爭作用、誘導植物抗病性。生防細菌最主要的抗菌機制是核糖體合成的細菌素、幾丁質酶和葡聚糖酶等抗菌蛋白以及次生代謝產生的抗生素與揮發性抗菌物質產生的拮抗作用。芽孢桿菌抑制植物病原菌的范疇很廣，包括根、莖、葉、花及果實病害，使其在植物病害生物防治中具有潛在的應用價值[7]。芽孢桿菌對環境友好、對人畜安全，是理想的生防菌篩選菌源，也是理想的生物農藥和生物菌肥的研發菌源，對生態農牧業的發展有重要意義。

以分離自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗場極端生境的植物根圍菌為供試菌株，通過平板對峙試驗測定菌株拮抗活性；16S rDNA及gyrB基因序列分析鑒定菌株；CMC平板法和Gram染色法測定菌株降解纖維素的能力，測定供試菌株促植物生長活性，為青藏高原農業、畜牧業及飼料加工產業提供了適應高原生態環境的可利用菌源。因此，探究草地生態系統中微生物功能，合理發掘利用微生物資源，對草地生態系統可持續發展具有重要的實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試芽孢桿菌菌株分離自青海托格若格半荒漠沙地駱駝蓬（Peganum L.）根圍、托素湖鹽堿地帶野生黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr）根圍、海北爆轟試驗場高山嵩草草甸（Kobresia pygmaea）根圍；病原指示菌油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum de Bary）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、小麥長蠕孢菌（Helminthosporium tritici-vulgaris）由青海大學高原草地資源與生態省部共建實驗室保存；小麥（Triticum aestivum Linn）種子（高原448號）由青海省農林科學院饋贈。

細菌培養LB（Luria-Bertani）培養基、真菌培養PDA（Potato Dextrose Agar）培養基、CMC-Na培養基配制參考文獻[8]配制。

引物由南京金斯瑞生物技術有限公司合成；PCR擴增反應試劑dNTP Mixture（CD117）購自北京天根生化科技有限公司；基因組序列測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集及菌株分離 土樣采自青海托格若格半荒漠沙地駱駝蓬根圍、托素湖鹽堿地帶野生黑枸杞根圍、海北爆轟試驗場高山嵩草草甸根圍。采用五點取樣法，用小鏟除去表土，取植物根部5～25 mm處土樣，裝入采樣袋內，標記好采樣植被、時間、地點等[9]。菌株分離采用平板稀釋法，稱取5 g土樣，將土壤研磨成粉末狀，放入45 mL生理鹽水中，搖床振蕩30 min，靜置使之澄清；用無菌水將其稀釋為10-1、10-2、10-3 3個濃度梯度，將稀釋液80 ℃金屬浴10 min后取出。吸取各濃度稀釋液200 μL涂布于LB固體培養基平板中，倒置于恒溫箱中，37 ℃過夜培養，挑取單菌落于新LB培養基中，37 ℃恒溫培養；挑取形態不同的單菌落接種于液體LB培養基中，37 ℃搖床過夜振蕩培養，用平板劃線分離法純化，直至獲得純培養[9]。

1.2.2 拮抗病原真菌活性測定 分別將26 ℃培養箱中活化后的油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長孢蠕菌PDA平板邊緣打取直徑為0.7 cm的菌碟， 接種在新PDA平板中央。在距離菌塊2.5 cm處3個接種點上放置直徑為4 mm的濾紙小圓片，吸取5 μL 37 ℃、200 r/min條件下培養14 h的芽孢桿菌菌液，接種于濾紙片上，每個處理重復3次，放入26 ℃恒溫培養箱中培養2～3 d，取出觀測并記錄抑菌結果[10]。

1.2.3 菌株分子鑒定 通過16S rDNA基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴增16S rDNA基因，正向引物127F：5′-AGAGTTTGATCMTG

GCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GCYTACCTTGTT

ACGACTT-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。將擴增產物測序，所得序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對[11]。

通過gyrB基因序列分析鑒定菌株，以菌株基因組DNA為模板擴增gyrB基因，正向引物gyrB-For：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGG NAARTTYGA-3′，反向引物gyrB-Rev：5′-AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGT CAT-3′。PCR擴增條件：95 ℃ 4 min；98 ℃ 10 s，62 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30個循環；72 ℃ 8 min；4 ℃ 10 min。將擴增產物測序，所得序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對[12]。

1.2.4 菌株降解纖維素活性測定 在CMC篩選培養基平板上設置3個接種點，放置直徑為4 mm的濾紙小圓片。將供試菌株在LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下振蕩培養12 h，取菌液5 μL于濾紙片中央，每個處理重復3次，將平板倒置于37 ℃恒溫培養箱中培養2 d，將革蘭氏碘染液（Gram iodime）注入并淹沒平板表面，蓋上平皿蓋，靜置4 min后，倒去染液，觀測并記錄結果。測定并記錄透明圈直徑、菌落直徑，并計算兩者比值A[13]。

1.2.5 菌株促生活性測定 選擇種皮完好的小麥種子（高原448號）在20%次氯酸鈉溶液中消毒處理20 min，無菌水沖洗3～4次；將種子在菌懸液中浸種24 h（菌懸液稀釋濃度106 CFU/mL），無菌水處理作對照；將浸種后的種子播于鋪有濾紙的培養皿中，置于光照培養箱中培養（28 ℃，光周期16 h/8 h），培養5 d后觀察種子的萌發情況，測定芽長、根長和鮮重，統計芽孢桿菌對植物的催芽效果；每個處理重復3次，每個重復選50粒種子進行測定和記錄[9]。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌分離

在菌株分離過程中，土壤稀釋液經80 ℃金屬浴10 min，普通細菌被滅活，而芽孢桿菌為適應高熱環境而形成孢子，通過LB培養基培養初步分離得到。從青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地、海北爆轟試驗場共分離到500余株菌株，根據不同的菌落形態，分別從托格若格樣點選擇10株菌株，托素湖樣點選擇10株單菌落，海北爆轟試驗場樣點選擇6株細菌單菌落進行純化培養（圖1）。

2.2 拮抗病原真菌活性

將分離的16株菌株多次轉接，選擇其中活性強的7株作為供試菌株，分別命名為BHC1、BHC4、BHC5、TGRG3、TGRG7、TSH5、TSH6。以油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長孢蠕菌為病原真菌指示菌，檢測菌株拮抗病原真菌活性。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5對3種病原真菌均具有明顯的拮抗病原真菌活性，抑菌圈直徑>20 mm（表1）。

2.3 菌株分子鑒定

2.3.1 16S rDNA序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因組DNA為模板，擴增16S rDNA基因片段，擴增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶（圖2）。將PCR產物測序結果在NCBI中，用BLAST軟件與GenBank中己知序列進行比對。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5與芽孢桿菌B. subtilis ATCC49760（登錄號：CP014840.1）的16S rDNA序列同源性皆為99%。

2.3.2 gyrB基因序列分析 以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5基因組DNA為模板擴增gyrB基因片段，擴增到大小約1 300 bp的PCR特征性條帶（圖2）。將PCR產物測序結果在NCBI中，用BLAST軟件與GenBank中己知序列進行比對。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5與枯草芽孢桿菌B. subtilis ATCC49760（登錄號：CP014840.1）的gyrB基因序列同源性分別為97%、96%、98%（表2）。

2.4 降解纖維素活性

以菌株TGRG3、TGRG7、TSH5作為供試菌株，檢測菌株降解纖維素活性。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纖維素為惟一碳源的CMC-Na培養基上，分別形成直徑為13.0、14.3、14.3 mm的降解透明圈，D/d（透明圈直徑D與菌落直徑d之比）分別為2.06、2.04、1.96，表現出降解纖維素活性。菌株降解纖維素的活性A與D/d呈正相關，即D/d越大，菌株降解纖維素活性越強（圖3、表3）。

2.5 菌株促生效果測定

將菌株TGRG3、TGRG7、TSH5發酵液分別制備成細胞濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，對小麥進行浸種處理，以無菌水浸種作為對照，播種培養5 d后統計小麥幼苗根長、芽長及鮮重。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后的小麥芽長與對照組相比分別增長6.50%、1.45%、2.89%。菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后小麥根長較對照分別增長33.49%、3.52%、12.05%；菌株TGRG3、TGRG7、TSH5菌懸液處理后小麥鮮重較對照分別增加30.00%、15.31%、23.05%。其中，菌株TGRG3菌懸液對根長的促生效果尤為顯著（表4）。

3 討論

青藏高原強烈的地形變化、獨特的大氣環流和氣候的多樣性，提供了多樣性的生物棲息環境，為極端微生物資源的研究開發及應用提供了平臺[14]。本研究以分離篩選自青海托格若格半荒漠沙地、托素湖鹽堿地帶、海北爆轟試驗場3個極端生境植物根圍菌為供試菌株，以油菜菌核病菌、小麥赤霉菌、小麥長孢蠕菌為病原指示菌，測定供試菌株的拮抗活性。結果表明，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5對3種病原真菌均具有明顯拮抗活性，抑菌圈直徑均大于20 mm。

16S rDNA和gyrB基因常被用于細菌鑒定，利用核糖體16S rDNA基因序列保守區域設計引物，此引物能與多數種屬的核糖靶位點結合[11]；gyrB即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發生較多的變異而不改變氨基酸序列，尤其是密碼子的第3位堿基，使gyrB基因序列在區分鑒定細菌近緣種方面較非蛋白編碼基因16S rDNA更精確[12]。本研究對菌株TGRG3、TGRG7、TSH5進行16S rDNA及gyrB基因序列分子鑒定，綜合兩種鑒定結果，3株菌株均被鑒定為枯草芽孢桿菌。對菌株TGRG3、TGRG7、TSH5進行促生效果測定，與對照相比，3株菌株對高原小麥品種的芽長、根長和鮮重均有不同程度的促生效果，其中菌株TGRG3對根長的促生效果最為顯著。3株菌株分離篩選自高原極端生境，可促進植物生長、提高地上生物量，在高原植被恢復、生態農業發展方面具有一定的應用潛力[15]。CMC平板及Gram染色法檢測菌株降解纖維素活性，菌株TGRG3、TGRG7、TSH5可在以纖維素為惟一碳源的培養基上正常生長，表明菌株可產生纖維素降解酶，表現出明顯的纖維素降解活性。在飼料加工生產及作物秸稈還田中，若利用生防菌株分泌產生的纖維素降解酶來加速草料或秸稈木質纖維素的降解，可使飼料營養物質降解為容易被牲畜吸收利用的單糖、寡糖成分，使養分得到更有效的釋放[16]，對飼料加工生產、農田土壤結構和肥力的改善都有重要意義[17]。

本研究分離篩選自青海極端生境的枯草芽孢桿菌菌株適應高原特殊生境，兼具拮抗活性、降解纖維素活性及促生活性，可作為生物菌肥和生物農藥的研發菌源，并可作為飼料加工生產中改善飼料木質纖維素降解的有益菌源，在農牧業生產及飼料加工中具有一定的研究及應用潛力。

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