7份紅豆草對低溫的生理響應及抗寒性評價

田豐 于闖 付雙軍 南麗麗

摘要：為了解不同紅豆草材料在越冬期根系對低溫脅迫的響應特征及其抗寒性強弱，以7份紅豆草（5份來自俄羅斯、2份來自國內）為供試材料，對紅豆草根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量、脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性等6項生理指標的動態變化進行了監測。結果表明，供試紅豆草材料根系可溶性糖含量（WWS）、可溶性蛋白質含量（SP）和脯氨酸含量及CAT活性和POD活性均隨著氣溫下降而增加，隨氣溫升高而減少，MDA含量呈下降趨勢。經抗寒隸屬度分析，得出其抗寒性由大到小的順序為ZXY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005p-623、ZXY2007p-3423。從俄羅斯引進的紅豆草材料ZXY2003p-132和ZXY2010p-7369比國內紅豆草品種蒙農紅豆草、甘肅紅豆草抗寒性強。

關鍵詞：紅豆草；種質資源；生理生化；抗寒性

中圖分類號：S541；Q945.7 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）10-0021-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.10.008

Physiological Response of 7 Onobrychis viciifolia on Low Temperature and

Its Evaluation of Cold Resistance

TIAN Feng 1，2，3，4， YU Chuang1，2，3，4， FU Shuangjun1，2，3，4， NAN Lili1，2，3，4

（1. College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070，China；2. Key Laboratory of Grassland Ecosystem of Ministry of Education， Lanzhou Gansu 730070， China；3. Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province，Lanzhou Gansu 730070， China；4. Sino-U. S. Centers for Grazing land Ecosystem Sustainability， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to understand the response characteristics and cold resistance of different Onobrychis viciifolia cultivars to low temperature stress during overwintering， with 7 Onobrychis viciifolia cultivars （5 from Russia and 2 from China） being used as material， the dynamic changes of 6 physiological indexes in the roots of Onobrychis viciifolia were monitored， such as the contents of soluble sugar， soluble protein， proline （Pro） and malondialdehyde （MDA）， activity of catalase （CAT） and peroxidase （POD） activity. The results showed that the soluble sugar content （WWS）， soluble protein content （SP）， proline content， CAT activity and POD activity of roots of Onobrychis viciifolia increased with the decrease of air temperature， but decreased with the increase of air temperature， the content of MDA showed a downward trend. According to the analysis of the degree of Cold resistance subordination， the order of cold resistance from large to small was ZXY2003p-132， ZXY2010p-7369， Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Mengnong， Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Gansu， ZXY2003p-147， ZXY2005p-623， ZXY2007p-3423. The materials of Onobrychis viciifolia XY2003p-132 and ZXY2010p-7369 introduced from Russia have stronger cold resistance than domestic cultivars Onobrychis viciaefolia. Scop. cv. Mengnong， Onobrychis viciaefolia. Scop.cv. Gansu.

Key words：Onobrychis viciifolia；Germplasm resources；Physiological and biochemical；Cold resistance

紅豆草（Onobrychis viciaefolia）具有固氮、耐旱、耐寒、耐鹽堿、適應性強、產量高、品質優抗病和速生等特點，堪稱“牧草皇后”，富含蛋白質、氨基酸、粗脂肪和礦物質，草質柔軟，氣味芳香，葉量豐富，可用于青飼、青貯、放牧、曬制青干草、加工草粉、配合飼料和多種草產品[1 ]。紅豆草含有單寧，可沉淀在動物瘤胃中形成大量泡沫性可溶性蛋白質，故反芻家畜在青飼、放牧時不易發生膨脹病，是畜禽的上等飼料。紅豆草花冠粉紅色，顏色嬌美且花期長，是發展庭院經濟和很好的蜜源植物，為干旱區、半干旱區、高寒區很有發展前途的豆科牧草。

低溫冷（凍）害是高寒牧區頻發的自然災害之一，嚴重影響并制約著優質豆科牧草的生長發育。我國審定登記的紅豆草品種數量少（僅3個）且老化[2 - 3 ]。目前對其生產性能及營養價值、誘變選育、基因克隆、抗病性、光合特征等方面進行了研究[4 - 10 ]，然而關于不同紅豆草種質抗寒性的對比研究鮮見報道。

為豐富我國紅豆草種質資源，為抗寒新品種選育提供原始材料，我們以農業部從俄羅斯引進及國內審定登記的紅豆草為種質材料，在田間自然降溫條件下，分析其對根系生理的影響，并用隸屬函數法對參試材料抗寒性進行鑒定，以篩選應對低溫脅迫的抗寒性材料及抗寒性鑒定指標，為其進一步開發利用及科學栽培奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在甘肅農業大學蘭州牧草試驗站進行，試驗地位于東經105° 41'，北緯34° 05'，地處黃土高原西端，屬溫帶半干旱大陸性氣候。當地海拔 1 525 m，年均氣溫9.7 ℃，年均降水量200～320 mm，年均蒸發量1 664 mm，年均無霜期90～210 d。試驗地土壤為黃綿土，黃土層較薄，0～20 cm土層土壤含有機質8.44 g/kg、速效氮95.05 mg/kg、速效磷7.32 mg/kg、速效鉀82.45 mg/kg，pH為7.50。

1.2 試驗材料及田間種植

供試紅豆草材料共7份，ZXY2010p-7369（I）、ZXY2003p-132（Ⅱ）、ZXY2007p-3423（Ⅲ）、ZXY

2005p-623（Ⅳ）、ZXY2003p-147（Ⅴ）均從俄羅斯引進； 蒙農紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop.cv. Mengnong）（Ⅵ），由內蒙古農業大學提供；甘肅紅豆草（Onobrychis viciaefolia Scop. cv. Gansu）（Ⅶ），由甘肅農業大學提供。試驗共設7個處理，每份材料為1處理，3次重復，小區面積10 m2（2 m×5 m），相鄰2個小區設0.5 m的保護行。試驗采用完全隨機排列，于2014年7月28日人工開溝條播，播深3 cm，行距30 cm，播量為60 kg/hm2。試驗期間各小區均不施肥，不灌溉。

1.3 取樣與測定方法

分別于2015年11月1日、12月1日及2016年1月1日、2月1日、3月1日從各試驗小區中隨機挖取供試材料的根系，取長10 cm的根及根頸用錫箔紙包裹，放入液氮罐帶回實驗室保存在-80 ℃冰箱備用。采用蒽酮比色法測定可溶性糖（WSS）含量，考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白質（SP）含量，酸性茚三酮法測定脯氨酸（Pro）含量，硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量，紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性 [11 - 15 ]。各測定指標均3次重復。

1.4 數據處理和評價方法

用Excel對數據進行處理，用SPSS 20.0統計軟件進行方差分析（Duncan新復極差法）和主成分分析。應用Fuzzy數學中隸屬度函數法進行綜合評判[16 ]，對與抗寒性呈正相關參數的WSS、SP、Pro、CAT和POD采用公式Fij=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin），對與抗寒性呈負相關參數的MDA采用公式Fij=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。式中，Fij為i品種的j性狀測定的具體隸屬值；Xij為i品種j性狀測定值；Xjmin為i品種j性狀中測定的最小值；Xjmax為i品種j性狀中測定的最大值；然后將每個供試材料所有性狀的具體隸屬值進行累加，求平均值，得到其隸屬度。

2 結果與分析

2.1 越冬表現

越冬率能夠直觀的反映植株在同一田間條件下抗寒能力的強弱。由圖1可知，2015年11月至2016年3月的平均氣溫在0.5～2.1℃波動，平均土溫在1.1～5.0 ℃波動。其中2016年1月份的平均氣溫和土溫均最低，分別為-7.8 ℃和-6.9 ℃。經觀測，在上述條件下，不同紅豆草材料田間越冬率均達100%，可見在蘭州地區各供試紅豆草材料均能安全越冬。

2.2 根系可溶性糖含量的變化

由表1可見，各供試紅豆草的可溶性糖含量隨著生育期推移先增后降。2015年11月至2016年1月，可溶性糖含量均顯著增加（P < 0.05），且在1月份達到最大值，材料Ⅱ、Ⅶ的可溶性糖含量顯著高于其余材料；2016年1—3月，可溶性糖含量均顯著降低（P < 0.05），且在2016年3月份其含量達到最小值，材料Ⅳ可溶性糖含量顯著低于材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ（P < 0.05）。

2.3 根系可溶性蛋白質含量的變化

由表2可見，各供試紅豆草的可溶性蛋白質含量變化均表現為隨氣溫的降低而增加，隨氣溫的回升而下降。2015年11月至2016年1月，可溶性蛋白質含量緩慢升高，材料Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ在2016年1月達最大值，分別是2015年11月份的9.87%、14.74%和7.69%；2016年1—2月，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ的可溶性蛋白質含量持續升高并在2月份達到最大值，分別是2015年11月的1.45、1.50、1.38、1.11倍，其余材料均緩慢下降；2016年2月后可溶性蛋白質含量均降低，且材料Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ在2016年3月達到最小值。

2.4 根系脯氨酸含量的變化

由表3可見，各供試紅豆草的脯氨酸含量隨溫度季節變化均呈現先上升后下降的趨勢。2015年11月至2016年1月，各材料的脯氨酸含量迅速積累升高，在2016年1月達到峰值，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的脯氨酸含量分別是2015年11月份的11.77、1.24、2.43、1.39、2.08、4.30、1.44倍，且材料Ⅱ的脯氨酸含量顯著高于其余材料（P < 0.05）。2016年1月之后，脯氨酸含量快速下降，除材料Ⅳ、Ⅶ外，其余材料2016年3月份的脯氨酸含量均顯著高于2015年11月份的含量（P < 0.05），且材料Ⅱ明顯高于其余材料（P < 0.05）。

2.5 根系MDA含量的變化

由表4可見，各供試紅豆草的MDA含量隨著生育期的推移均呈下降趨勢。2015年11月初，各供試材料的MDA含量有明顯差異（P < 0.05）；2015年11月至2016年1月，隨著氣溫的降低各供試紅豆草的MDA含量均表現緩慢下降。2016年1月之后，MDA含量持續降低并于2016年3月份達到最小值，此時材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的MDA含量比2015年11月份分別下降了85.78%、69.98%、48.66%、26.70%、52.54%、34.64%和55.50%，且材料Ⅰ和Ⅱ的MDA含量顯著低于其余材料（P < 0.05）。

2.6 根系CAT活性的變化

各供試紅豆草根系CAT對低溫脅迫反應敏感，其受低溫影響變化情況見表5，各材料的CAT活性隨氣溫的變化均呈現先增加后下降趨勢。11月到翌年1月，CAT活性快速增加，在1月均達到最大值，材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的CAT活性是11月份的2.28、3.56、2.08、1.99、1.38、1.15、2.35倍，且材料Ⅰ和Ⅲ的CAT活性顯著（P < 0.05）高于其余材料，說明CAT活性的增加能夠幫助植物更有效地清除自由基，材料Ⅰ和Ⅲ清除自由基的能力更強。1月到3月，隨著氣溫回升，CAT活性急劇下降，材料Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ CAT活性下降速度較快，較1月份分別下降了73.13%、67.22%和72.74%。

2.7 根系POD活性的變化

由表6可見，各供試紅豆草的POD活性與CAT活性變化趨勢基本一致。2015年11月至2016年年1月，各材料的POD活性急劇升高并在2016年1月份達到最高水平，此時材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ的POD活性是2015年11月份的2.69、1.96、2.46、1.51、1.92、1.15、1.69倍，且材料Ⅱ的POD活性顯著高于其余材料（P < 0.05），表明紅豆草根系在遭受低溫脅迫后，POD活性增加以抵抗自由基的氧化傷害。2016年1 — 3月，各材料POD活性急劇下降，材料Ⅱ的POD活性顯著高于其余材料（P < 0.05）；除材料Ⅰ、Ⅳ之外，其余材料POD活性均在2016年3月份達到最低水平。

2.8 抗寒性綜合評價

采用隸屬函數法，將不同紅豆草種質6項抗寒參數隸屬函數值加起來求其平均值得其綜合評價值，抗寒性強弱順序依次為ZXY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005p-623、ZXY2007p-3423（圖2）。

3 結論與討論

植物在逆境下的生長和發育都是受限的，它對外界刺激的反應就是合成和積累大量的蛋白質和與應激耐受性相關的小分子物質[17 ]。低溫脅迫下脯氨酸、可溶性蛋白質、可溶性糖等滲透調節物質可降低細胞水勢，增強持水力，也可緩和細胞外結冰后細胞失水，增強膜的穩定性，亦是植物越冬、再生的能量和物質來源，與植物抗寒性密切相關[18 ]。本研究表明，盡管隨著氣溫的降低不同供試紅豆草材料的根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量和脯氨酸含量都表現增加的趨勢，但脯氨酸含量增加的趨勢最明顯且呈線性增加，可溶性蛋白質含量的增加幅度相對較小；可溶性糖含量在最冷月到來時也迅速增加，表明不同紅豆草材料在低溫到來時首先通過快速積累脯氨酸防止細胞失水，保護生物大分子結構和功能的穩定，以減少冷害；后期脯氨酸含量和可溶性糖含量繼續增加，可降低紅豆草組織的冰點，減少結冰傷害。

低溫脅迫下，植物體內產生大量的活性氧自由基，引發膜脂過氧化，產生膜脂過氧化產物MDA，對細胞產生傷害作用[19 ]。同時植物體內還存在著CAT、POD等抗氧化酶系統以清除活性氧、減輕逆境脅迫對植物細胞造成的傷害[20 - 21 ]。本研究表明，低溫脅迫下，紅豆草根系CAT活性、POD活性持續升高，MDA 含量持續降低，CAT活性和POD 活性的增加可以減輕低溫對生物膜的迫害，對細胞起到保護作用。

植物抗寒性是多基因控制的數量性狀，單一的生理指標難以全面準確反映抗寒性的強弱，可結合與抗寒性有關的多個指標進行抗寒性評 價[22 ]。隸屬函數分析提供了一條在多指標測定基礎上對植物抗寒性進行綜合評價的途徑。本研究運用隸屬函數法對不同紅豆草根系可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量、脯氨酸含量、MDA含量、CAT 活性及POD活性 6 個生理指標進行綜合分析，結果表明，7份供試紅豆草材料抗寒性由大到小依次為ZXY2003p-132、ZXY2010p-7369、蒙農紅豆草、甘肅紅豆草、ZXY2003p-147、ZXY2005 p-623、ZXY2007p-3423，從俄羅斯引進的紅豆草種質材料ZXY2003p-132和ZXY2010p-7369較國內2份材料蒙農紅豆草、甘肅紅豆草抗寒性強，這為抗寒新品種選育提供了原始材料。

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（本文責編：鄭立龍）