小麥HMW-GS毛細(xì)管電泳高效分離體系研究

王衛(wèi)東，高 翔,2，何慶夢，姚曉露，劉 陽，楊明明,2，李建芳,2，楊 娜

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100；2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城 044000)

小麥(TriticumaestivumL.)貯藏蛋白主要包括醇溶蛋白和谷蛋白兩大類，依據(jù)分子量大小可將谷蛋白進(jìn)一步分為高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)[1]。其中，HMW-GS與面筋彈性和延展性密切相關(guān)，是參與形成谷蛋白多聚體的主要成分[2]；HWM-GS的組合不同則產(chǎn)生的品質(zhì)效應(yīng)不同[3]。對小麥品種中HMW-GS的分離鑒定已成為品質(zhì)研究的重要環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)方法分離小麥HMW-GS多采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)和高效液相色譜(HPLC)等[4-7]。SDS-PAGE分離所需時間較長，對樣品需求量較大，分離效果容易受環(huán)境及人為因素影響，且在鑒定亞基類型時需要對照“Payne命名系統(tǒng)”，準(zhǔn)確性低，一些遷移率接近的亞基難以被區(qū)分。雖然結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)可以在一定程度上彌補(bǔ)這一缺點(diǎn)，但由于特異性引物種類有限、實(shí)驗(yàn)前需要對種子發(fā)苗、提取和純化樣品DNA等，工作效率較低。HPLC較 SDS-PAGE方法克服了很多不足，但其成本較高，適用范圍窄。HPCE(毛細(xì)管電泳)技術(shù)以其進(jìn)樣少、運(yùn)行成本低、快速、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，被越來越多地應(yīng)用于小麥HMW-GS研究[8-11]。

HPCE中，分離介質(zhì)緩沖液的選擇至關(guān)重要。目前，應(yīng)用于小麥貯藏蛋白分離的常規(guī)HPCE緩沖系統(tǒng)主要包括磷酸鹽緩沖液系統(tǒng)、硼酸鹽緩沖液系統(tǒng)、乳酸鋁緩沖液系統(tǒng)及Prosot SDS。Bietz[12]最早將酸性磷酸鹽緩沖液與堿性硼酸鹽緩沖液引入到HWM-GS的HPCE中，并獲得了較好的分離效果。Werner等[13]首次使用乳酸鋁緩沖液分離小麥HMW-GS，并成功鑒定了多個品種的亞基組成，之后又以Prosort SDS為緩沖劑對HMW-GS相關(guān)特性進(jìn)行了研究[14]。Sutton等[15]在Prosot SDS中加入5%甲醇，對HMW-GS的HPCE鑒定圖譜進(jìn)行了研究。Bean等[16]使用Phos-gly(磷酸-甘氨酸)緩沖液對HMW-GS進(jìn)行HPCE電泳分離，相比前人獲得了更好的分辨率及分離效果。

上述應(yīng)用于小麥HMW-GS分離的HPCE緩沖液系統(tǒng)，雖然具有較好的分離效率，但重現(xiàn)性較差，對亞基的定性分析尚顯不足，不利于亞基標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜的構(gòu)建。本試驗(yàn)以普通小麥中國春為標(biāo)準(zhǔn)樣，引入亞氨基二乙酸(IDA)緩沖液系統(tǒng)[17]，擬通過研究毛細(xì)管電泳中不同緩沖液組分濃度、緩沖液pH、分離電壓、進(jìn)樣時間、運(yùn)行溫度、毛細(xì)管內(nèi)徑等對亞基分離的影響，確立小麥HMW-GS的HPCE高效分離體系，并通過連續(xù)重復(fù)試驗(yàn)、混合進(jìn)樣分析對體系的分離效率及重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證，以期為HPCE定性分析及標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜的構(gòu)建提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥品種中國春、石4185、陜182，由國家小麥改良中心楊凌分中心品質(zhì)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 小麥HMW-GS的提取

參照文獻(xiàn)[7]的方法并作改進(jìn)：將單粒種子研磨成粉后加1 mL 70%乙醇振蕩30 min，20 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液；向沉淀中加入1 mL提取液A(50%異丙醇)，混勻，60 ℃水浴30 min；室溫下13 000 r·min-1離心10 min，棄上清，重復(fù)此步驟2次。向沉淀中加入150 μL提取液B[50%異丙醇+3 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)+25 g·L-1二硫蘇糖醇]，混勻后60 ℃水浴30 min。加入150 μL提取液C[50%異丙醇+3 mol·L-1Tris-HCl(pH=8.8)+10 g·L-14-乙烯基吡啶]，65 ℃繼續(xù)水浴1 h。將水浴后產(chǎn)物于20 ℃ 13 000 r·min-1離心15 min，取120 μL上清液，加入80 μL預(yù)冷(-20 ℃)的丙酮溶液，使丙酮占總體積的40%。將混合液于-20 ℃冰箱中沉淀過夜，20 ℃ 13 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，所得沉淀即為HMW-GS。

1.2.2 毛細(xì)管電泳系統(tǒng)運(yùn)行前后處理

將1.2.1所得的蛋白沉淀烘干，加入200 μL蛋白溶解液(每50 mL含：15 mL丙三醇+18 g尿素+75 μL乙酸)，于35 ℃水浴溶解1 h，-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂们俺暶摎狻Ｅc毛細(xì)管電泳相關(guān)的緩沖液及沖洗試劑均由超純水配置，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，20 ℃、50 W超聲脫氣15 min。

電泳分離前的沖洗程序?yàn)椋篘2反向吹干1 min，1 mol·L-1H3PO4沖洗2 min，0.1 mol·L-1NaOH沖洗2 min，去離子水沖洗1 min，緩沖液沖洗3 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用0.1 mol·L-1NaOH沖洗2 min，反向去離子水沖洗1 min。

1.2.3 毛細(xì)管電泳分離體系的優(yōu)化

使用P/ACE MDQ plus毛細(xì)管電泳儀(Beckman，USA)對樣品進(jìn)行分析。毛細(xì)管配置為檢測長度27 cm的石英非涂層毛細(xì)管(USA)。IDA緩沖液組分為：IDA(亞氨基二乙酸)+HPMC(羥丙基甲基纖維素)+ACN(乙腈)。利用控制變量法，對緩沖液系統(tǒng)及電泳分離參數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化，確立HMW-GS毛細(xì)管分離最佳體系。緩沖液系統(tǒng)pH設(shè)置為2.2、2.5、2.8；緩沖液組分中IDA濃度設(shè)置為50、75、100 mmol·L-1；HPMC濃度設(shè)置為0、0.05%、0.5%；ACN濃度設(shè)置為10%、15%、20%。電泳參數(shù)中，分離電壓設(shè)置為15、20、25 kV；運(yùn)行溫度設(shè)置為25、30、35 ℃；毛細(xì)管內(nèi)徑設(shè)置為25、50 μm；進(jìn)樣時間設(shè)置為5、8 s。

1.2.4 HMW-GS毛細(xì)管電泳分離體系重現(xiàn)性驗(yàn)證

利用構(gòu)建好的HPCE高效分離體系，對小麥品種中國春的HMW-GS進(jìn)行連續(xù)30次及連續(xù)多天電泳分離，檢驗(yàn)毛細(xì)管電泳圖峰形、基線穩(wěn)定性。將中國春與石4185、陜182混合進(jìn)樣，比較該體系與常規(guī)Phos-gly/ACN體系(磷酸-甘氨酸+HPMC+ACN)的分離效率及圖譜分辨率，計(jì)算各亞基出峰時間的RSD值，驗(yàn)證分離重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液系統(tǒng)pH的選擇

依據(jù)Salmanowicz等[18]、Yan等[19]的研究，毛細(xì)管電泳分離圖譜中，中國春的HMW-GS具有四個特征峰，按遷移時間順序分別為1Dy12→1By8→1Bx7→1Dx2。由圖1可知，在緩沖液為100 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+20% ACN，采用25 μm內(nèi)徑毛細(xì)管，214 nm檢測波長，分離電壓15 kV，運(yùn)行溫度25 ℃，10.0 kV電進(jìn)樣5 s條件下，緩沖液pH對HMW-GS峰高、峰寬及基線均有顯著影響。pH為2.8時，8.13 min出現(xiàn)1Dy12亞基主峰；1By8主峰出峰時間為9.97 min，峰高較低，主峰辨別度差，且峰后有基線的波動；1Bx7主峰出峰時間為11.54 min；1Dx2主峰出現(xiàn)在13.12 min；從1Dy12到1Dx2亞基峰時間跨度為4.99 min；整體上看基線有明顯的上升趨勢。pH為2.5時，四個主峰出峰時間分別為10.24、11.94、13.40和15.00 min；相比pH2.8時出峰時間較晚，時間跨度稍有減小(4.76 min)，但整體峰形對稱、分離度較高、基線相對平穩(wěn)。pH為2.2時，四個主峰出峰時間為11.57、12.55、14.31和16.08 min，時間跨度為4.51 min；相比pH為2.5、2.8，峰寬度增大、分離度降低；而且在臨近1Dy12亞基主峰時基線波動較大，1By8主峰與1Bx7主峰之間也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象。說明pH為2.5時亞基分離效果較好。

A、B、C曲線所對應(yīng)的pH分別為2.8、2.5、2.2。

The corresponding pH of A,B and C curves are 2.8,2.5 and 2.2,respectively.

圖1不同pH緩沖液對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.1EffectofdifferentpHofbufferonelectrophoresisseparationofHMW-GS

2.2 緩沖液系統(tǒng)組分濃度的選擇

2.2.1 IDA濃度的選擇

如圖2所示，緩沖液為：0.05% HPMC+20% ACN，pH 2.5。電泳條件為：毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運(yùn)行溫度25 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s，中國春的HMW-GS亞基整體遷移速率隨IDA濃度的增大而加快，濃度對亞基峰高、峰形及基線狀況影響不大。比較相同IDA濃度下連續(xù)兩針的電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，IDA濃度對電泳分離重現(xiàn)性的影響較大。IDA濃度為50 mmol·L-1時，亞基遷移速率最慢，電泳第一針與第二針之間的出峰時間差異最大。IDA濃度為100 mmol·L-1時，亞基遷移最快，連續(xù)兩針間電泳出峰時間差值減小，但仍然較大，且在1Dy12主峰之前出現(xiàn)了基線的波動。IDA濃度為75 mmol·L-1時，亞基遷移速率介于50和100 mmol·L-1之間，兩針間電泳出峰時間幾乎重合，亞基峰形、基線均保持較高的一致性，電泳分離重現(xiàn)性較高。說明IDA濃度為75 mmol·L-1的亞基分離效果較好。

A和B、C和D、E和F曲線分別表示IDA濃度為100、75、50 mmol·L-1時電泳第一針、第二針。

A and B,C and D,and E and F represent the first and second electrophoresis when the concentration of IDA was 100 mmol·L-1,75 mmol·L-1and 50 mmol·L-1,respectively.

圖2不同IDA濃度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.2EffectofdifferentconcentrationofIDAontheelectrophoresisseparationofHMW-GS

2.2.2 HPMC濃度的選擇

如圖3所示，緩沖液為75 mmol·L-1IDA+20% ACN，pH 2.5。電泳條件為：毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運(yùn)行溫度25 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s。HPMC濃度對HMW-GS分離度及基線狀況有顯著影響。不添加HPMC時，亞基遷移速度最快，但峰之間未完全分離，主峰界線不明顯，且峰形不規(guī)則。HPMC濃度為0.5%時，峰寬明顯變窄，亞基分離度最高，但基線噪音較大，影響了圖譜的分辨率。HPMC濃度為0.05%時，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2四個主峰出峰時間分別為12.40、14.07、15.54和17.16 min，亞基分離度介于0與0.5%濃度之間，雖然亞基遷移速率降低，但主峰峰形對稱，且基線噪音很小，圖譜分辨率高。說明HPMC濃度為0.05%時最佳。

2.2.3 ACN濃度的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05 % HPMC，pH 2.5，毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓15 kV，運(yùn)行溫度25 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s。添加不同濃度ACN，對HMW-GS毛細(xì)管電泳分離的影響主要集中在主峰分離度上(圖4)。ACN濃度為20%時，四個主峰分離度最低。ACN濃度為10%時，主峰分離度最大，但是峰寬增大、峰高明顯降低，即亞基縱向擴(kuò)散與峰展寬比例減小，影響圖譜的分辨率。當(dāng)ACN濃度為15%時，主峰分離度介于前兩者之間，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2主峰依次出現(xiàn)在12.68、14.32、16.80和18.94 min，亞基峰形清晰對稱，基線噪音最低。因此，ACN濃度為15%最佳。

A、B、C曲線分別對應(yīng)HPMC濃度0.5%、0.05%、0。

A,B and C curves correspond to 0.5%,0.05% and 0 of HPMC,respectively.

圖3不同HPMC濃度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.3EffectofdifferentconcentrationofHPMConthe

electrophoresisseparationofHMW-GS

A:20% ACN; B:15% CAN; C:10% ACN.圖4 不同ACN濃度對HMW-GS電泳分離的影響Fig.4 Effect of different concentration of ACN on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3 毛細(xì)管電泳分離條件的選擇

2.3.1 毛細(xì)管分離電壓的選擇

利用已經(jīng)優(yōu)化好的IDA緩沖液系統(tǒng)，對毛細(xì)管電泳運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行逐步優(yōu)化，進(jìn)一步提高HMW-GS分離效果。

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH為2.5；毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長214 nm，運(yùn)行溫度25 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s。如圖5所示，當(dāng)分離電壓為15 kV時，基線水平、亞基分離度較高，但是峰高相對較低，且遷移速度最慢。當(dāng)電壓增大為20 kV時，主峰分離度未受明顯影響，與15 kV差異不大，亞基峰高明顯增大、整體遷移速率明顯加快，圖譜分辨率得到了提升。電壓達(dá)到25 kV時，雖然獲得了最大遷移速率及峰高，但是基線出現(xiàn)了整體下降的趨勢。由此可見，分離電壓的提高對遷移速率及峰高有促進(jìn)作用，但會增加分離不穩(wěn)定因素。綜合來看，20 kV分離電壓對HMW-GS的分離效果最佳。

A:15 kV; B:20 kV; C:25 kV.圖5 分離電壓對HMW-GS電泳分離的影響Fig.5 Effect of separation voltage on the electrophoresisseparation of HMW-GS

2.3.2 分離溫度的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長214 nm，分離電壓20 kV，10.0 kV進(jìn)樣5 s。當(dāng)分離溫度為25 ℃時，圖形清晰，亞基峰形對稱，四個主峰出峰時間依次為10.93、12.81、15.98和18.13 min(圖6)。溫度為30 ℃時，亞基分離度與25 ℃時接近，但亞基出峰更早；四大主峰分別出現(xiàn)在9.31、11.69、13.18和14.77 min，時間跨度為52.4 min，整體遷移速度更快；亞基縱向擴(kuò)散與峰展寬比例擴(kuò)大，從而帶來主峰辨識度的提高。溫度為35 ℃時亞基分離度達(dá)到最大，出峰時間分別為8.22、10.38、13.14和15.56 min，但是亞基峰高明顯變小，基線波動較大，噪音增強(qiáng)，導(dǎo)致圖譜分辨率明顯下降。由此可見，分離溫度為30 ℃時分離效果最好。

2.3.3 PDA檢測波長的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，分離電壓20 kV，運(yùn)行溫度30 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s。結(jié)果(圖7)表明，PDA檢測波長與分離圖譜中亞基峰寬和基線噪音密切相關(guān)，對峰高有輕微影響，對圖譜亞基出峰時間的影響不大。PDA波長由214 nm轉(zhuǎn)變?yōu)?00 nm時，基線噪音更小，亞基峰寬減小，峰高略微增大，這使得亞基縱向擴(kuò)散與峰展寬比例進(jìn)一步增大，帶來了主峰辨識度的提高。因此PDA檢測波長為200 nm時最佳。

A、B、C曲線分別對應(yīng)25、30和35 ℃。

A,B and C curves are 25,30 and 35 ℃,respectively.

圖6毛細(xì)管內(nèi)運(yùn)行溫度對HMW-GS電泳分離的影響

Fig.6Effectofthecapillarytemperatureonthe

electrophoresisseparationofHMW-GS

A:214 nm; B:200 nm.圖7 PDA檢測波長對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.7 Effect of PDA wavelengths on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3.4 進(jìn)樣時間的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm，檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運(yùn)行溫度30℃，10.0 kV進(jìn)樣。當(dāng)進(jìn)樣時間為5 s時，峰形清晰，亞基分離度高，基線平穩(wěn)。進(jìn)樣時間為8 s時，電泳遷移速率與進(jìn)樣5 s差異不大，但峰寬明顯增大，1Bx7、1Dx2主峰峰高顯著降低，四個主峰之間界線模糊，亞基分離度較差，圖譜分辨率降低(圖8)。因此，進(jìn)樣時間為5 s時分離效果好。

A:8 s; B:5 s.圖8 不同進(jìn)樣時間對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.8 Effect of different sampling time on theelectrophoresis separation of HMW-GS

2.3.5 毛細(xì)管內(nèi)徑的選擇

緩沖液為75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5；檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運(yùn)行溫度30 ℃，10.0 kV進(jìn)樣5 s。結(jié)果(圖9)表明，毛細(xì)管內(nèi)徑同時影響亞基峰寬、分離度及基線穩(wěn)定性。毛細(xì)管內(nèi)徑為25 μm時，亞基分離度高，亞基峰形對稱，基線水平，背景噪音低。當(dāng)毛細(xì)管內(nèi)徑為50 μm時，亞基分離度降低，峰寬增大，峰高降低；電泳遷移率降低，亞基出峰較晚，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2四個主峰依次出現(xiàn)在第10.81、12.24、13.78和15.58 min處；1Dy12主峰出峰之前有明顯的基線波動，電泳分離后期基線逐漸上升，且有倒峰及雜峰出現(xiàn)。由此可見，毛細(xì)管內(nèi)徑為25 μm時最佳。

2.4 HMW-GS毛細(xì)管電泳高效分離體系及驗(yàn)證

在優(yōu)化后條件下，即緩沖液組分為15% ACN+75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC，pH為2.5；毛細(xì)管內(nèi)徑25 μm， PDA檢測波長200 nm，分離電壓20 kV，運(yùn)行溫度30 ℃，樣品10.0 kV電進(jìn)樣5 s，對中國春的HMW-GS連續(xù)多次電泳分離。結(jié)果(圖10)發(fā)現(xiàn)，第1～2 min為系統(tǒng)峰(溶劑峰)，3～6 min為微量LMW-GS區(qū)域，HMW-GS在9 min后開始出峰，1Dy12、1By8、1Bx7、1Dx2亞基16 min內(nèi)全部分離完成。連續(xù)30次、連續(xù)6 d重復(fù)試驗(yàn)(圖10、11)，均顯示圖譜亞基峰形一致、分離度高、基線水平。通過混合進(jìn)樣方式，與常規(guī)的Phos-gly/ACN體系進(jìn)行對比。

A:25 μm; B:50 μm.圖9 不同毛細(xì)管內(nèi)徑對HMW-GS電泳分離圖譜的影響Fig.9 Effect of different inner diameters of the capillaryon the electrophoresis separation of HMW-GS

圖中所示曲線從下往上依次為第1、5、10、15、20、25、30次電泳分離曲線。

The curves from bottom to top are first,fifth,tenth,fifteenth,twentieth,twenty-fifth and thirtieth electrophoresis separation curves,respectively.

圖10中國春HMW-GS連續(xù)30次毛細(xì)管電泳分離圖譜

Fig.10Imageofthirtyconsecutiveinjections

ofHMW-GSofChineseSpring

圖中所示曲線從下往上依次為第1、2、3、4、5、6天電泳分離曲線。

The curves from bottom to top are the curves of the first day,the second day,the third day,the fourth day,the fifth day and the sixth day,respectively.

圖11中國春HMW-GS連續(xù)6d電泳圖譜

Fig.11ContinuousrepeatedexperimentofHMW-GSofChineseSpringforsixdays

結(jié)果(圖12、表1)表明，該體系在亞基分離速度、圖譜分辨率上更具有優(yōu)勢，對于遷移率比較接近的亞基(如1Dy12與1Dy10、1By9與1By8、1Dx5與1Dx2)更容易表征；亞基出峰時間RSD(<0.2%)值遠(yuǎn)小于后者，說明分離重現(xiàn)性更高。

A、B均為中國春(Null，7+8，2+12)與石4185(1，7+9，2+12)、陜182(1，7+8，5+10)混合樣的分離圖譜。圖A電泳條件：25 μm毛細(xì)管，200 nm檢測波長，緩沖液組分75 mmol·L-1IDA+0.05% HPMC+15% ACN，pH 2.5，分離電壓20 kV，運(yùn)行溫度30 ℃，10.0 kV電進(jìn)樣5 s。圖B電泳條件為：25 μm毛細(xì)管，214 nm檢測波長，緩沖液組分100 mmol·L-1Phosphate-glycine+0.05% HPMC+20% ACN，pH 2.5，分離電壓12.5 kV，運(yùn)行溫度40 ℃，10.0 kV電進(jìn)樣5 s。

A and B are both the separation curves obtained from the mixture of Chinese Spring(Null,7+8,2+12) ,Shi 4185(1,7+9,2+12) and Shaan 182(1,7+8,5+10).The electrophoresis conditions of Fig.A:Inner diameter of the capillary was 25 μm; Detection wavelength was 200 nm; Buffer composition was 75 mmol·L-1IDA + 0.05% HPMC + 15% ACN,with pH at 2.5; Separation voltage was 20 kV; Operating temperature was 30 ℃; Samples were injected for five seconds by electric method under under 10.0 kV.The electrophoresis conditions of Fig.B:Inner diameter of the capillary was 25 μm;Detection wavelength was 214 nm; Buffer composition was 100 mmol·L-1phosphate-glycine + 0.05% HPMC + 20% ACN,with pH at 2.5;Separation voltage was 12.5 kV;Operating temperature was 40 ℃;Samples were injected for five seconds by electric method under under 10.0 kV.

圖12 不同分離體系效果比較

表中數(shù)據(jù)為連續(xù)30次電泳分離所得平均值。

The data is the average value obtained from 30 consecutive injections.

3 討 論

小麥HMW-GS與小麥品質(zhì)密切相關(guān)，其分離鑒定是品質(zhì)研究的重要環(huán)節(jié)。與傳統(tǒng)方法相比，HPCE具有快速、自動化、分辨率高等特點(diǎn)。依據(jù)電泳圖譜可獲得亞基的準(zhǔn)確峰高、遷移時間等，有助于亞基定性及定量分析。本試驗(yàn)結(jié)果表明，HPCE分離體系中緩沖液pH、緩沖液組分、分離電壓、運(yùn)行溫度、進(jìn)樣時間、檢測波長及毛細(xì)管內(nèi)徑等條件的變化均會影響分離效果。

Bean等[20]最先將IDA/ACN緩沖系統(tǒng)應(yīng)用到蛋白HPCE分析中，主要對醇溶蛋白的分離進(jìn)行了探討，本試驗(yàn)首次將其引入到HMW-GS的HPCE分析中，通過優(yōu)化條件，同樣獲得了良好的分離效果。Righetti等[21]表明IDA/ACN緩沖液系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的最佳pH為2.2～2.8。本研究發(fā)現(xiàn)，pH > 2.5會導(dǎo)致基線不穩(wěn)定趨勢增加。由于HMW-GS屬于大分子蛋白[22]，容易吸附在毛細(xì)管壁上，使電滲流改變，影響電泳分離重復(fù)性，極端pH可以抑制蛋白吸附，維持電滲流穩(wěn)定，但當(dāng)pH達(dá)到一定范圍時，該作用將顯著減弱。推測pH>2.5時抑制作用降低，電泳后期HMW-GS吸附作用增強(qiáng)，從而產(chǎn)生了較多的焦耳熱，導(dǎo)致了基線的上升。IDA在毛細(xì)管電泳中主要影響分離的重現(xiàn)性，本研究結(jié)果表明，其濃度為75 mmol·L-1時，分離體系重現(xiàn)性較好。HPMC是一種親水高分子聚合物[23]，在緩沖液系統(tǒng)中具有充當(dāng)篩分介質(zhì)[24]和動態(tài)修飾的作用[25]，影響亞基分離度及基線狀況。HPMC濃度增大可能提高毛細(xì)管電泳靈敏度，但相應(yīng)的圖譜噪音也會增強(qiáng)。適當(dāng)降低濃度可增大亞基分離度。由于緩沖液中HPMC濃度的改變亦可影響其粘性，緩沖介質(zhì)粘性是影響電滲流的主要因素之一[26]，因此控制HPMC濃度有助于穩(wěn)定毛細(xì)管電泳電滲流。ACN在緩沖液系統(tǒng)中的作用是通過加快樣品堆積，促進(jìn)遷移速率[27]，其濃度的變化往往影響電泳靈敏度，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ACN濃度提高時圖譜噪音也會相應(yīng)增高，再次驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。由于HPCE是以高壓電場為驅(qū)動力，溫度影響著管內(nèi)溶液的粘性[28]，因此兩者數(shù)值升高均會提高圖譜遷移速率，但也為電泳系統(tǒng)帶來不穩(wěn)定因素。本試驗(yàn)中，PDA檢測波長對分離效果的影響主要是在圖譜分辨率上，由于不同物質(zhì)的最大吸收波長不同[29]，改變PDA檢測波長則會引起圖譜信噪比的變化。電壓進(jìn)樣時間往往會影響進(jìn)樣塞的長度，進(jìn)樣塞長度過大時容易使峰展寬大于縱向擴(kuò)散[30]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，增大毛細(xì)管內(nèi)徑，會使分離度降低、基線波動，這可能是因?yàn)槊?xì)管作為分離通道，其內(nèi)徑對散熱影響較大；減小其內(nèi)徑有利于電泳過程中熱量的散出，減少焦耳熱的產(chǎn)生；內(nèi)徑過大，容易在毛細(xì)管內(nèi)部形成溫度梯度(中心溫度高)，破壞塞流，進(jìn)而導(dǎo)致亞基縱向擴(kuò)散小于區(qū)帶展寬[31]，降低分離效率。

本研究通過分析HPCE中不同因素對HMW-GS分離效果的影響，結(jié)合連續(xù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)及比對驗(yàn)證，成功構(gòu)建了基于IDA緩沖液系統(tǒng)的HPCE高效分離體系，由于該體系下圖譜亞基分離度高、重現(xiàn)性好，因此有利于HMW-GS的定性分析。結(jié)合SDS-PAGE及分子標(biāo)記等，可對HPCE分離圖譜中不同類型HMW-GS進(jìn)行表征，確定標(biāo)準(zhǔn)遷移時間。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遷移時間，即可完成小麥材料中相關(guān)HMW-GS的快速鑒別。同時，該指標(biāo)亦可作為新型未知亞基的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] SHEWRY P R,TATHAM A S,LAZZERI P.Biotechnology of wheat quality [J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1997,73(4):399.

[2] PAYNE P I,NIGHTINGALE M A,KRATTIGER A F,etal.The relationship between HMW glutenin subunit composition and the bread-making quality of British-grown wheat varieties [J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,1987,40(1):64.

[3] WIESER H,ZIMMERMANN G.Importance of amounts and proportions of high molecular weight subunits of glutenin for wheat quality [J].EuropeanFoodResearch&Technology,2000,210(5):329.

[4] VISIOLI G,COMASTRI A,IMPERIALE D,etal.Gel-based and gel-free analytical methods for the detection of HMW-GS and LMW-GS in wheat flour [J].Foodanalyticalmethods,2016,9(2):474.

[5] HAJAS L,SCHERF K A,TRK K,etal.Variation in protein composition among wheat(TriticumaestivumL.) cultivars to identify cultivars suitable as reference material for wheat gluten analysis [J].FoodChemistry,2017,5:5.

[6] HOSSEIN M,REZA M.Characterization of wheat gluten subunits by liquid chromatography ? Mass spectrometry and their relationship to technological quality of wheat [J].JournalofCerealScience,2017,76:233.

[7] JANG Y R,BEOM H R,ALTENBACH S B,etal.Improved method for reliable HMW-GS identification by RP-HPLC and SDS-PAGE in common wheat cultivars [J].Molecules,2017,22(7):1055.

[8] JIANG P,GAO J,ZHENG X,etal.Clustered transcription initiators and expression of HMW-GS genes in wheat endosperm [J].CropScience,2017,57(1):384.

[9] LOOKHART G L,BEAN S R,JONES B L.Separation and characterization of barley(HordeumvulgareL.) hordeins by free zone capillary electrophoresis [J].Electrophoresis,1999,20(7):1611.

[10] LOOKHART G L,BEAN S R.Improvements in cereal protein separations by capillary electrophoresis:Resolution and reproducibility [J].CerealChemistry,1996,73(1):85.

[11] LOOKHART G,BEAN S.Separation and characterization of wheat protein fractions by high-performance capillary electrophoresis [J].CerealChemistry,1996,72(6):530.

[12] BIETZ J A.Fractionation of wheat gluten proteins by capillary electrophoresis [J].GlutenProteins,1993:406.

[13] WERNER W E,WIKTOROWICZ J E,KASARDA D D.Wheat varietal identification by capillary electrophoresis of gliadins and high molecular weight glutenin subunits [J].CerealChemistry,1994,71(5):400.

[14] WERNER W E.Ferguson plot analysis of high molecular weight glutenin subunits by capillary electrophoresis [J].CerealChemistry,1995,72:248.

[15] SUTTON K H,BIETZ J A.Variation among high molecular weight subunits of glutenin detected by capillary electrophoresis [J].JournalofCerealScience,1997,25(1):9.

[16] BEAN S R,LOOKHART G L.Faster capillary electrophoresis separation of wheat proteins through modifications to buffer composition and sample handling [J].Electrophoresis,1998,19(18):3191.

[17] LOOKHART G L,BEAN S R.Ultrafast CE analysis of cereal storage proteins and its applications to protein characterization and cultivar differentiation [J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2000,48:353.

[18] SALMANOWICZ B P,LANGNER M,FRANASZEK S.Charge-based characterisation of high-molecular-weight glutenin subunits from common wheat by capillary isoelectric focusing [J].Talanta,2014,129:14.

[19] YAN Y,JIANG Y,SUN M,etal.Rapid identification of HMW glutenin subunits from different hexaploid wheat species by acidic capillary electrophoresis [J].CerealChemistry,2004,81(5):565.

[20] BEAN S R,LOOKHART G L.Ultrafast capillary electrophoretic analysis of cereal storage proteins and its applications to protein characterization and cultivar differentiation [J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2000,48(2):350.

[21] RIGHETTI P G,OLIVIERI E,VIOTTI A.Identification of maize lines via capillary electrophoresis of zeins in isoelectric,acidic buffers [J].Electrophoresis,1998,19(10):1740.

[22] DENG Z,TIAN J,LIU X.Accumulation regularity of protein components in wheat cultivars with different HMW-GS [J].ActaAgronomicaSinica,2004,30(5):484.

[23] SARKAR N,WALKER L C.Hydration-dehydration properties of methylcellulose and hydroxypropyl methylcellulose [J].CarbohydratePolymers,1995,27(3):183.

[24] ORIARD M.Separation of proteins with capillary electrophoresis in coated capillaries with and without electroosmosis studies on zone broadening and analytical performances [J].ActaUniversitatisUpsaliensis,2006,19(1):50.

[25] MACHISTE E O,BUCKTON G.Dynamic surface tension studies of hydroxypropylmethylcellulose film-coating solutions [J].InternationalJournalofPharmaceutics,1996,145(1-2):197.

[26] YIN S,SU M,XIE G,etal.Factors affecting separation and detection of bile acids by liquid chromatography coupled with mass spectrometry in negative mode [J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2017:6.

[27] STEFAN A R,DOCKERY C R,NIEUWLAND A A,etal.Forensic analysis of anthraquinone,azo,and metal complex acid dyes from nylon fibers by micro-extraction and capillary electrophoresis [J].Analytical&BioanalyticalChemistry,2009,394(8):2081.

[28] 陳 義.毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000:15.

CHEN Y.Technology and application of capillary electrophoresis [M].Beijing:Chemical Industry Press，2000:15.

[29] POTIER I L,BOUTONNET A,ECOCHARD V,etal.Chemical and instrumental approaches for capillary electrophoresis(CE)-fluorescence analysis of proteins [M]//Nguyet Thay Tran,Myrian Tavema.Capillary Electrophoresis of Proteins and Peptides.Nwe York:Humana Press,2016:1-10.

[30] WATZIG H,DETTE C.Capillary electrophoresis(CE)-a review.Strategies for method development and applications related to pharmaceutical and biological sciences [J].DiePharmazie,1994,49(2-3):93.

[31] WESTON A,BROWN P R,JANDIK P,etal.Factors affecting the separation of inorganic metal cations by capillary electrophoresis [J].JournalofChromatographyA,1992,593(1):294.