微生物法生產香料化合物的研究

張媛媛，李濤

(青島科技大學 化工學院，山東 青島 266000)

從化學的角度來看，香料分子由許多獨特的結構和官能團組成，這些化學特性賦予它們各種不同的氣味；除了食品和飲料，香料工業還囊括香水、清潔產品、肥皂、洗滌劑和口腔保健產品等。

自然界中，氣味通常是動物種間或種內交流的一種形式，動物通過氣味來吸引共生伙伴，震懾捕食者。有些氣味分子是機體代謝物，可用作天然殺蟲劑、信息素或天然產物的前體。除了供人類消費，一些合成的香料化合物還可作為高能燃料、溶劑以及藥物前體。

從發展歷史來說，植物提取是香料化合物最初的、主要的來源，人們深入分析植物殘渣鑒別出單一組分，推動了人工合成法的發展；此后生物技術的發展則為香料生產開辟了又一可行的合成途徑，并在香料高效、靈活、低能耗的生產要求下應運而生。理論上，每一種天然香味分子都對應一種生物合成方法，通過確定合適的生物合成路徑和宿主，控制其代謝通量，優化基因背景并調控基因的表達，我們就能夠實現目標化合物的高效生產。本文對利用各種微生物、底物及生化途徑生產典型香料化合物的研究進展進行了綜述。

1 乙偶姻

乙偶姻是具有黃油風味的天然物質，它是細菌發酵生產2,3-丁二醇的中間體。此前已有乙偶姻生物法生產的相關報道,如通過山梨糖菌、生膜菌作用于2,3-丁二醇獲得或者通過青霉菌等真菌作用于甘蔗汁獲得[1],但這些方法均不適合工業化生產。研究發現，乙偶姻的生物合成始于兩分子丙酮酸縮聚生成乙酰乳酸，該過程由乙酰乳酸合成酶催化；之后乙酰乳酸脫羧酶催化乙酰乳酸脫羧生成乙偶姻。自然界中有許多微生物能夠合成乙偶姻，研究較多的主要包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及氣單胞菌屬(Aeromonas)等[2]。如：在相應的兩種酶存在的情況下，大腸桿菌能作用于葡萄糖生成乙偶姻。使用這一方法能夠得到滴定度高達870 mg/L 的乙偶姻，見表1[3]。

乙偶姻生物合成也可使用天然酵母。首先丙酮酸脫羧酶將丙酮酸活化進而形成乙醛-噻胺二磷酸酯復合物，之后該復合物再與另一分子乙醛縮合生成乙偶姻。為了優化乙偶姻的代謝通量，需將基因組中編碼乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的基因敲除；另外，為避免乙偶姻還原為2,3-丁二醇，編碼2,3-丁二醇脫氫酶的基因也要敲除掉。這一方法使得乙偶姻的生產達到7.3 g/L，相應產量為0.07 g/g ，生產率為0.11 g/L/h ，見表1[4]。

相似的是使用枯草芽孢桿菌來生產乙偶姻，趙祥穎等[5]選育獲得了一株高產枯草芽孢桿菌，稱可有效轉化葡萄糖生成乙偶姻，且不產生副產物丁二酮和2,3-丁二醇。在自然條件下枯草芽孢桿菌通過前述乙酰乳酸/乙偶姻代謝途徑產出2,3-丁二醇；在移除2,3-丁二醇脫氫酶、提供NADH氧化酶的情況下能使乙偶姻產量提高35.3%而達到56.7 g/L，見表1[6]。

表1 微生物生產各種風味和香料化合物的滴度、產率和產量Table 1 Titer, productivity and yield for microbial productionof various flavors and flavoring compounds

注：T.M.為理論最大值；N.A.為無；glc為葡萄糖；ba為苯甲醛；gly為甘油。

2 甲基酮類

甲基酮具有精油和奶制品的香味，脂肪酸的β-氧化可產生不同長度碳鏈的甲基酮類化合物。大腸桿菌自有的β-氧化途徑始于脂肪酸轉化為酰基輔酶A，該過程由酰基輔酶A合成酶Fad D催化；之后，在酰基輔酶A脫氫酶Fad E的催化下，酰基輔酶A被氧化生成反-2-烯酰輔酶A；Fad B隨后β-羥基化、氧化該物質，生成β-酮酰輔酶A；再經Fad A催化硫解斷鍵，得到一分子乙酰輔酶A和一分子脂肪族酰基輔酶A。

生產中為了提高β-酮酰輔酶A的通量，需調控使大腸桿菌DH1中編碼異源酰基輔酶A氧化酶的基因和自有的編碼Fad B的基因，使其過表達，并從基因組中敲除編碼Fad A的基因；另外，Fad M也被過量表達，最終使甲基酮產量提高了700倍[7]。優化脂肪酸基因的表達能大幅提高甲基酮的產量，使其在發酵45 h后達到3.4 g/L，見表1[8]。

3 醛類和醇類

異丁醛是帶有支鏈的醛，具有葡萄酒和啤酒發酵過程中的麥芽香味，以前用于異丁醇生產的大腸桿菌代謝途徑可被截斷來生產異丁醛，在異丁醇制備途徑中，2-酮異戊酸(產自L-纈氨酸生物合成過程)首先脫羧形成異丁醛，然后異丁醛被還原生成異丁醇。使用大腸桿菌JCL260菌株生產異丁醛需缺失大量天然異丁醛還原酶基因以使其產量達到1.5 g/L/OD600[9]；原位產物移除結合相關基因缺失使得異丁醛產量最終達35 g/L(理論產量的45%)，見表1。

醛還原酶基因的缺失還有助于香草醛和苯甲醛的生物合成。

大腸桿菌中存在高通量的內源性莽草酸合成途徑，蘇云金芽孢桿菌則能通過莽草酸途徑將細胞代謝物轉化為終產物；香草醛則隨后由O-甲基轉移酶(智人)和羧酸還原酶(car，諾卡氏菌)催化而來。通過整合這些代謝途徑，敲除大腸桿菌中醛還原酶編碼基因能夠使香草醛產量達到119 mg/L(底物為葡萄糖，1.2%，W/V )，見表1[10]。

類似地，在大腸桿菌培養液中提供重組羧酸還原酶可以將苯甲酸鹽轉化為苯甲醛。甲基營養巴斯德畢赤酵母亦能實現由芐醇生成苯甲醛的生物氧化過程。在一個3 L的培養體系中，反應系統能夠將70.7 g 芐醇轉化成14.4 g 苯甲醛，生產率為97 mg/L/h ，見表1[11]。而且相比于苯甲酸鹽途徑，芐醇代謝途徑效價更高并可作用于經濟底物(如甲醇和甘油)。

4 萜類

萜類化合物在自然界中十分豐富，以異戊二烯為結構單元，廣泛應用于制藥和化妝品行業。從植物中提取萜缺乏經濟性，大規模的微生物生產途徑才能滿足萜類化合物巨大的市場需求。

月桂烯是一種單萜，常用作香葉醇、薄荷醇這類復雜化合物的骨架。通過甲羥戊酸的異源表達途徑、在tGPPS2(特異性香葉基二磷酸合酶)和月桂烯合成酶存在的條件下，大腸桿菌DH1也能夠生產月桂烯。通過優化基因的表達水平、碳源、反應介質以及十二烷雙分子層體系，72 h后月桂烯產量達到58 mg/L，見表1[12]。

檸檬烯具有獨特的柑橘香味，是一種重要的日用品，可以被添加到許多清潔產品、化妝品和香水中。大腸桿菌中的真核甲羥戊酸類異戊二烯途徑能夠將乙酰輔酶A轉化為活化的異戊二烯單元——異戊烯基焦磷酸酯和二甲基烯丙基焦磷酸酯，它們可以相互結合、環化形成檸檬烯及其衍生物。設計和優化該體系能夠使檸檬烯的滴定度達435 mg/L(1%的葡萄糖底物濃度)[13]。

線性單萜也可由甲羥戊酸途徑合成。 惡臭假單胞菌是具有高度溶劑耐受性的宿主生物且已被用作由甘油生產香葉酸的宿主。香葉酸具有甜味，木頭或樹葉氣味，并伴有淡淡的柑橘香。在香葉醇合成酶存在的情況下，惡臭假單胞菌能通過甲羥戊酸途徑生產香葉醇，而香葉醇可自發被氧化成香葉酸。通過優化甲羥戊酸代謝途徑、調整反應體系為饋料式生物反應器，經過2天的反應，由4.6 g/L甘油可產出193 mg/L的香葉酸，見表1[14]。

5 結論

目前，認識和發展微生物生化合成途徑已取得了一定進展，谷氨酸、香草醛和乙醇僅是利用微生物生產法得以大量生產的幾個實例。由于香料化合物結構的復雜性和潛在的宿主毒性，其生產效價仍有待提高；另外，利用微生物生產香料化合物的成本較高，所以我們要設法提高微生物對此類物質的耐受性，達到足夠高的反應效價；例如，當目標產物是長碳鏈、化學結構更復雜的化合物分子時，如何提高產量對我們而言則又是一個挑戰。

微生物法制備香料化合物具有反應條件溫和、產物可降解、香味純正持久等眾多優點，更符合綠色化學的時代潮流；隨著生物技術日新月異的發展和相關合成、分離提取技術的進一步完善,微生物生產法將成為更具發展前景的香料合成途徑。

參考文獻：

[1]張小舟,曾崇余,任曉乾.乙偶姻合成研究現狀及展望[J].江蘇化工,2001,29(2):29-31.

[2]陳元元,吳巖,劉曉光.乙偶姻生物合成代謝調控及其應用[J].生物學雜志,2014(5)：76-80,84.

[3]Nielsen D R,Yoon S H,Yuan C J,et al.Metabolic engineering of acetoin and meso-2,3-butanediol biosynthesis inE.coli[J].Biotechnol J,2010(5):274-284.

[4]Li S,Xu N,Liu L,et al.Engineering of carboligase activity reaction inCandidaglabratafor acetoin production[J].Metab Eng,2014,22:32-39.

[5]韓麗,趙祥穎,劉建軍.3-羥基丁酮的研究現狀[J].食品與發酵工業,2006,32(10):116-118.

[6]Zhang X,Zhang R,Bao T,et al.The rebalanced pathway significantly enhances acetoin production by disruption of acetoin reductase gene and moderate-expression of a new water-forming NADH oxidase inBacillussubtilis[J].Metab Eng,2014,23:34-41.

[7]Goh E B,Baidoo E E,Keasling J D,et al.Engineering of bacterial methyl ketone synthesis for biofuels[J].Appl Environ Microbiol,2012,78:70-80.

[8]Goh E B,Baidoo E E,Burd H,et al.Substantial improvements in methyl ketone production inE.coliand insights on the pathway from in vitro studies[J].Metab Eng,2014,26:67-76.

[9]Rodriguez G M,Atsumi S.Isobutyraldehyde production fromEscherichiacoliby removing aldehyde reductase activity[J].Microb Cell Fact,2012,11:90.

[10]Kunjapur A M,Tarasova Y,Prather K L.Synthesis and accumulation of aromatic aldehydes in an engineered strain ofEscherichiacoli[J].J Am Chem Soc,2014,136:11644-11654.

[11]Craig T,Daugulis A J.Polymer characterization and optimization of conditions for the enhanced bioproduction of benzaldehyde byPichiapastorisin a two-phase partitioning bioreactor[J].Biotechnol Bioeng,2013,110:1098-1105.

[12]Kim E M,Eom J H,Um Y,et al.Microbial synthesis of myrcene by metabolically engineeredEscherichiacoli[J].J Agric Food Chem,2015,63:4606-4612.

[13]Alonso-Gutierrez J,Chan R,Batth T S,et al.Metabolic engineering ofEscherichiacolifor limonene and perillyl alcohol production[J].Metab Eng,2013,19:33-41.

[14]Mi J,Becher D,Lubuta P,et al.De novo production of the monoterpenoid geranic acid by metabolically engineeredPseudomonasputida[J].Microb Cell Fact,2014,13:170.