黃瓜果刺大小遺傳分析

狄勝強 李 豪 欒倩倩 王麗娜 李 強 任仲海

（山東農業大學園藝科學與工程學院，山東果蔬優質高效生產協同創新中心，農業部黃淮地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018）

黃瓜刺瘤密度及大小決定了黃瓜果實的光滑程度。黃瓜刺瘤由果刺和果瘤兩種結構組成，而果刺又包括上部單細胞針狀刺和下部多細胞球狀基座（Yang et al.，2014）。多細胞基座決定果刺大小，當基座小到一定程度時，果刺即成為小且柔軟的毛刺，這時黃瓜果實也表現為光滑的外觀性狀。目前對黃瓜刺瘤的研究主要集中在刺瘤的有無及密度方面（楊雙娟 等，2011；Li et al.，2015；Pan et al.，2015；Zhang et al.，2016；Xie et al.，2018）， 雖 然已有對小刺基因定位的報道（杜輝，2008），但是果刺大小的遺傳規律仍不清楚。

曹辰興和郭紅蕓（1999）報道了無刺黃瓜自然突變體（glabrous 1，gl1），該突變體地上部均無毛，葉片有光澤。接著，曹辰興等（2001）對無刺基因（gl1）與果瘤基因（Tu-tu）的關系進行了初步探索，發現果刺和果瘤基因互作可產生有瘤有刺、無瘤有刺、無瘤無刺3種黃瓜類型，表明gl1對果瘤基因存在隱性上位作用。果瘤基因Tu編碼1個C2H2型鋅指蛋白，通過促進CTK（細胞分裂素）的合成誘導果瘤發育（Zhang et al.，2010；Yang et al.，2014）。Li等（2015）利用 gl1 突變體，定位并克隆了CsGL1，該基因編碼HD-ZIPⅠ亞家族的1個轉錄因子。楊雙娟等（2011）利用葉片無毛突變體NCG-042，以F2世代為作圖群體初步將無毛基因gl-2定位在黃瓜2號染色體上。控制黃瓜果刺和毛狀體起始及發育的CsGL3也已被克隆，該基因編碼HD-ZIPⅣ亞家族的1個轉錄因子，并被證明是CsGL1的上位基因（Pan et al.，2015；Cui et al.，2016）。CsGL3基因還參與調控黃瓜果刺密度，其啟動子區的812 bp片段替換是決定黃瓜果刺密度的關鍵因素（Zhang et al.，2016）。轉基因分析表明WD40家族基因CsTTG1也可以調控黃瓜刺瘤大小和密度（Chen et al.，2016），且是獨立于CsGL1的途徑來調控果刺及蠟粉腺毛的起始和發育。另一個調控果刺密度的基因ns （Csa2M264590）也已被克隆，功能注釋表明，該基因屬于Aux/Lax家族，編碼類似生長素轉運蛋白3，參與生長素信號轉導途徑（Xie et al.，2018），NS負調控果刺密度。黃瓜小刺基因（ss）只有初步的定位結果（杜輝，2008）。

黃瓜果刺對保護果實免受病蟲及紫外線等的傷害具有一定作用。黃瓜多細胞果刺的發育機制與擬南芥中單細胞表皮毛發育機制有著顯著的不 同（Hülskamp et al.，1999；Hülskamp，2004；Schellmann & Hülskamp，2005；Li et al.，2015）。黃瓜果刺大小遺傳規律分析與基因挖掘，有助于闡明多細胞果刺發育機制，也對黃瓜果實光滑性狀的改良具有重要的理論和指導意義。

本試驗以大果刺黃瓜自交系CNS5和小果刺黃瓜自交系RNS4為親本，構建了P1、F1、P2、B1、B2和F26世代群體，利用主基因+多基因混合遺傳模型（蓋鈞鎰 等，2003），對黃瓜果刺大小（基座直徑）的遺傳規律進行初步分析，以期為制定果刺大小相關基因定位策略提供一定的依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用親本材料P1和P2分別為CNS5和RNS4，均為山東農業大學蔬菜分子遺傳學實驗室保存的中國華北型黃瓜自交系。親本CNS5果刺大，RNS4果刺小，兩親本間果刺基座大小差異明顯（圖1）；2015年秋季將兩親本種植于山東農業大學園藝試驗站溫室，雜交獲得子代F1（CNS5×RNS4）和 F1′（RNS4×CNS5）。2016年春季種植 F1，自交獲得子代F2，同時用2個親本分別與F1回交獲得回交群體B1（CNS5/RNS4//CNS5）和B2（CNS5/RNS4//RNS4）。以此獲得CNS5和RNS4雜交組合的 6 個世代群體，即 P1、F1、P2、B1、B2和 F2。

圖1 親本及F1的幼果和兩親本果刺基座對比

1.2 田間試驗

2016年秋季及2017年春季分別將6個世代群體種植于山東農業大學園藝試驗站拱棚。播種前施腐熟農家肥。株距40 cm，行距50 cm，每行10株，生育期田間正常水肥管理，及時除草，防治病蟲害。選取開花當天順直無畸形的幼果，去掉頂花，拍照后用于果刺基座測量，每株取3個幼果，即為3次生物學重復。

1.3 黃瓜果刺測量部位及測量時期

黃瓜果刺的發育是一個循序漸進的過程，因而確定具體的測量部位和測量時期對表型鑒定起著至關重要的作用。依據Chen等（2016）介紹的方法，本試驗將果刺基座直徑的測量部位確定為幼果中間部分（圖2）。該部位的果刺形狀整齊、規則，能夠代表整瓜的果刺大小。

圖2 黃瓜幼果果刺基座測量部位及局部放大圖

兩親本的果刺發育進程統計表明（圖3），黃瓜雌花幼果開花前是黃瓜果刺的快速發育期，果刺（主要是基座）急劇膨大，至開花當天果刺發育基本達到最大，開花后果刺膨大趨于平緩。鑒于開花當天（0 DAA）的幼果花瓣完全展開，顏色鮮艷黃亮，是黃瓜幼果發育階段最易辨識的形態標記；且果刺已過了快速膨大期，能夠代表黃瓜果實的果刺大小；統一將開花當天的黃瓜幼果確定為果刺表型鑒定的最佳時期，力求表型鑒定的準確性與可靠性。

圖3 黃瓜果刺發育過程

1.4 果刺基座測量方法

果刺基座測量所用的軟件為Image J，使用默認參數（Pascau & Mateos，2013），其步驟為：①雙擊打開Image J，進入File菜單，選擇Open導入目標照片。② 通過Ctrl+來調節照片大小至200%且果刺基座輪廓清晰。③ 定義工具欄上點選直線工具圖標，在照片中直尺上對應長度畫1條直線，進入Analyze菜單，點擊Set Scale，設定照片中相對比例的實際大小。Distance in pixels為照片中的直線長度，Known distance為實際的直線長度。④ 在幼果中間部位，選擇圓形規則的果刺基座，直線垂直測量果刺基座直徑（圖2），通過快捷鍵Ctrl+M統計所選的果刺基座直徑。⑤ 每個果實測量10個果刺，統計完成后將數據儲存為 *.xlsx文件。

1.5 統計分析方法

數據整理采用軟件Microsoft Excel 2007，基本參數統計、差異顯著性比較使用軟件DPS7.05（唐啟義和馮明光，2007），多世代頻率作圖及曲線擬合采用軟件Origin Pro 2016（葉衛平，2015）。使用由蓋鈞鎰和章元明等提出的主基因+多基因混合遺傳模型分離分析法對6世代P1、F1、P2、B1、B2和F2進行聯合分析。通過極大似然分析和IECM（Iterated expectation and conditional maximization）算法估計混合分布中的相關分布參數（章元明和蓋鈞鎰，2000），再依據 AIC（Akaike’s information criterion）值最小原則選擇最佳模型并進行適合性檢驗，包括均勻性U12、U22和U32檢驗，Smirnov檢驗（nW2）和Kolmogorov檢驗（Dn），選擇最優模型。最后采用最小二乘法依據最優模型的各成分分布參數估計遺傳參數。遺傳分析R語言優化軟件包SEA1.0由華中農業大學章元明教授惠贈。

2 結果與分析

2.1 表型數據分析

2.1.1 果刺基本參數 親本CNS5（P1）果刺大且多（圖1-B），親本RNS4（P2）果刺小且少（圖1-C），幼果大小差異不大，F1果刺大小（基座直徑）介于兩親本之間。統計結果表明，P1、P2與F1相互之間果刺大小差異極顯著，適合進行遺傳特性分析（圖4）。

圖4 親本與雜交一代果刺基座直徑統計

由表1可知，各世代變異系數均小于15%，說明數據精度符合進一步分析的要求。2016年秋季和2017年春季各世代種植分離群體中，F1果刺大小均介于兩親本之間。B1、B2和F2果刺大小也介于兩親本P1與P2之間（表1）。連續兩年的F1果刺大小基本一致且都介于兩親本之間，說明控制果刺大小的等位基因不是簡單的顯隱性關系。

2.1.2 分離世代次數分布及曲線擬合 由分離世代可知，在2016年秋季群體中，50株B1和48株B2世代的分離值都介于兩親本之間，而在102株的F2群體中出現最小的果刺基座，為0.61 mm，雖然小于P2的最小果刺基座0.63 mm，但仍在誤差范圍之內，應該不是負向超親優勢（表1）。2017年春季群體中，B1中最大果刺基座為1.19 mm，高于當年親本P1的最大果刺基座1.10 mm，雖差異明顯，但群體中僅有2株，不足以說明存在正向超親優勢（表1）。果刺基座表型值連續分布，對各分離世代的頻率分布進行曲線擬合，結果表明，2016年秋季和2017年春季的果刺基座表型值在各分離世代B1、B2和F2中均表現出正態分布（圖5），呈現數量遺傳特征。

表1 CNS5×RNS4 6世代果刺基座直徑基本參數統計

圖5 2016年秋季和2017年春季果刺大小頻率分布

2.2 果刺大小主基因+多基因遺傳模型分析

2.2.1 果刺大小遺傳模型選擇 利用主基因+多基因混合遺傳模型的6世代（P1、F1、P2、B1、B2和F2）聯合分析法，估算出果刺大小的5類24種遺傳模型的極大似然函數值和AIC值（表2）。根據最佳模型的AIC值最小原則從表2中選出AIC值最小的模型以及與最小AIC值最接近的1個遺傳模型作為備選模型。即在2016年秋季AIC值最小為-580.5的C-0模型作為可能的最佳候選模型，接近最小AIC值-576.5的D-0模型為備選模型。2017年春季C-0模型的AIC值最小，為-1 422.5，也作為可能的最佳候選模型，AIC值為-1 418.5的D-0模型作為備選模型（表2）。

表2 CNS5×RNS4組合后代各遺傳模型的AIC值

2.2.2 果刺大小候選模型的適合性檢驗 對選出的候選模型進行均勻性檢驗，Smirnov（nW2）檢驗和 Kolmogorov（Dn）檢驗（表3），選出統計量達顯著水平個數較少的模型為最優模型。結果表明，2016年秋季群體中，C-0和D-0模型中沒有統計量的差異達到顯著水平。2017年春季群體中，C-0和D-0模型中均有1個檢驗統計量差異達到顯著水平。再結合AIC值最小原則，選擇C-0作為連續兩年的果刺大小最優遺傳模型，即為典型的加性-顯性-上位性多基因混合遺傳模型，無主基因存在，多基因加性和顯性效應、上位性效應累計均為正向。

表3 CNS5×RNS4群體適合性檢驗

2.2.3 果刺大小遺傳參數估計 對適合果刺大小的C-0模型進行遺傳參數估計，一階遺傳參數結果表明，2016年秋季和2017年春季的6個世代群體的平均值差異不大（表4）。從二階遺傳參數的估計值可以看出（表5），2016年秋季B1、B2和F2群體中，果刺大小多基因遺傳方差分別為0.001 1、0.003 2和0.006 3；多基因遺傳率分別為40.06%、65.91%和79.21%，環境方差占表型方差的值分別為59.94%、34.09%和20.79%。在2017年春季的B1群體中多基因遺傳方差為0.004 9，多基因遺傳率為71.13%，環境方差占表型方差的28.87%；B2群體的多基因遺傳方差為0.005 2，多基因遺傳率為72.46%，環境方差占表型方差的27.54%；F2群體的多基因遺傳方差為0.004 9，多基因遺傳率為71.25%，環境方差占表型方差的28.75%。由此可見，該群體中果刺大小的多基因遺傳率較高，無主效基因存在，受環境影響相對較小。在遺傳育種上，應將早代選擇和高代選擇相結合。在基因定位策略選擇上不宜利用F2世代分離群體進行定位，結合高代回交群體進行基因定位效果可能會更好。

表4 CNS5×RNS4 雜交組合果刺大小的一階遺傳參數估計值（C-0模型）

表5 CNS5×RNS4 雜交組合果刺大小的二階遺傳參數估計值（C-0模型）

3 結論與討論

主基因+多基因混合遺傳模型是由蓋鈞鎰等提出的數量性狀遺傳分析方法，在大豆（劉陽 等，2016）、小麥（李樹華 等，2017）、水稻（鄭燕 等，2011）、黃瓜（曹明明 等，2018）、油菜（汪文祥等，2016）、胡麻（化青春 等，2016）等多種作物的遺傳研究中得到了廣泛的應用。本試驗利用主基因+多基因混合遺傳模型分析法，對2016年秋季和2017年春季2個生長季節的6世代群體P1、F1、P2、B1、B2和F2的黃瓜果刺大小的遺傳規律進行了初步分析。結果表明，F1的果刺大小介于兩親本之間。F2分離群體果刺大小表現為無明顯分組的連續變異，基本符合正態分布，屬于數量性狀。其遺傳模型符合C-0模型，即加性-顯性-上位性多基因混合遺傳模型，多基因加性和顯性效應均為正向，多基因遺傳力相對較高，存在多基因聯合效應，且微效基因數目較多，受環境影響也相對較小。連續兩季的F2多基因遺傳率分別為79.21%和71.25%，多基因遺傳率較高且相差不大；與2016年秋季結果相比，2017年春季B1和B2群體的多基因遺傳率更高，且差異不大。這可能與2017年春季群體較大，變異相對穩定有關，相應地，所得結果也更可靠。在遺傳育種上，應將早代選擇和高代選擇相結合。在基因定位方面不宜利用F2分離群體進行定位，結合高代回交群體或者利用存在主效基因的群體定位果刺大小相關基因效果可能會更好。

對比連續兩季3個分離群體B1、B2和F2的果刺大小變化范圍（表1），可以發現，2016年秋季幾乎沒有出現大于親本P1和小于親本P2的極端表型值，而2017年春季有個別大于親本P1的極端表型值。一方面，可能是由于隨著種植群體的加大，果刺大小的極端值出現的幾率增大；另一方面，也可能是由于春季溫度較高，使得分離群體出現極端值的幾率增大，可見環境對試驗結果的影響也不容忽視。

黃瓜果刺隨著前期果實的快速生長而同步膨大，至開花當天達到最大，之后不再膨大。但據筆者觀察，有的黃瓜品種隨著果實發育成熟果刺有變小的現象。黃瓜開花后，在成熟過程中黃瓜的主要生長中心逐漸轉向果實的膨大和種子的成熟，大量的養分運往果實或種子用于生長，作為外在保護性器官的果刺不再是主要的生長中心，從而失去了縱向和橫向繼續生長能力。受外在溫度、水分等脅迫的影響，果刺有失水縮小、硬化等現象。果實發育成熟果刺變小的這種現象除與品種、栽培條件有關外，可能也有相應的基因控制該進程。因此選擇開花當天鑒定果刺表型結果相對準確。

多基因控制的數量性狀受環境的影響較大，不同的栽培環境如溫度、濕度等的不同變化會導致較大的差異。2016年秋季群體（圖5）的頻次分布可能由于群體較小，受極端天氣的影響以及分組太大導致統計差異比較大，表現為不是特別典型的正態分布。果刺基座本身就小，有時拍照時的環境光線不穩定，部分照片質量會受到影響，會對部分數據的統計造成較大誤差。2017年春季B1、B2和F2群體的頻率分布則更傾向于正態分布（圖5）。由此可知，群體越大所得結果也相對更可靠。數量性狀的表型效應是與環境共同作用的結果，無論其相關基因表現為主效基因還是多效基因，都與環境的互作有關（向道權 等，2001）。

主基因+多基因混合遺傳模型是研究數量性狀遺傳規律的一種有力工具，依據作物表型值分析遺傳規律。該體系綜合了其他經典遺傳學的優勢，可以進行單個數量性狀基因鑒別研究，包含多種類型，依不同群體使用對應的類型，容易操作，可以區分出數個主基因數量和效應。目前為止最多可預測到兩對主效基因和相應的遺傳率，但是當群體預測處在微效多效基因區時，與經典遺傳學無異，只能預測多基因的遺傳效率，卻預測不到更多更具體的多基因數量（劉陽 等，2016）；不同群體中，同一性狀的不同類型會有不同的表現，這是該模型的局限所在（狄佳春 等，2016）。盡管如此，該模型在多種作物中的廣泛使用和所得結果為其數量性狀育種的選育時期、QTL基因定位策略的制定提供了重要的參考。對該體系的進一步優化和發展（章元明，2012），增加主效基因的預測數量并提高其預測的準確性和精確性，也會為遺傳育種工作者提供更可靠、更精準的數量遺傳信息。

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