辣椒ToMMV的分子鑒定

陳靈芝張 茹魏兵強王蘭蘭高彥萍張 武

〔1甘肅省農業科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070；2甘肅省馬鈴薯脫毒種薯（種苗）病毒檢測及安全評價工程技術研究中心，甘肅蘭州 730070〕

辣椒病毒病是近年來甘肅省辣椒生產中普遍發生的病害，植株一旦被病毒病感染，常表現為葉片皺縮、斑駁、黃化、花葉、壞死、畸形和植株矮化，且發病率極高，傳播迅速，易造成嚴重減產，產量損失達20%～70%。徐秉良（2001）報道侵染甘肅省辣椒的主要病毒為CMV，文朝慧等（2010）利用DAS-ELISA和RT-PCR法對甘肅省制種基地辣椒病樣進行檢測，結果表明TMV和CMV是優勢毒原種群，檢出率分別為44.4%和33.3%。

筆者多年來從事辣椒雜交育種工作，自2014～2016年在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚、試驗地分別發現辣椒幼苗和成株疑似感染病毒病，主要癥狀表現為幼苗從第1片真葉畸形，葉片皺縮、黃化，個別植株生長點壞死。此后，隨著幼苗生長及定植，癥狀有所緩解，但在9、10月辣椒采收后期，葉片皺縮、黃化、畸形癥狀加重。對辣椒病毒病病原種類進行準確的鑒定是進行有效防控和篩選抗毒種質的前提。在參考前人對辣椒病毒病鑒定的工作基礎上，本試驗以采集于甘肅省農業科學院蔬菜研究所試驗地的病樣為材料，利用TMV/CMV雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒（DAS-ELISA）和RT-PCR方法進行病原的檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病毒病發病調查及樣品采集

2015年3月至2016年9月，在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗田調查病毒病發生情況，并采集疑似感染病毒病的樣品。

2015年3月在育苗棚采集病樣25份，2016年3月和9月在育苗棚、試驗田采集病樣47份，健康樣品5份，樣品保存于4 ℃冰箱和液氮中。分別進行CMV/TMV雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（DASELISA）檢測及RT-PCR檢測。

1.2 DAS-ELISA檢測

用于DAS-ELISA檢測的抗體及陽性、陰性對照樣品為美國Agdia公司產品。取采集到的新鮮待測樣品按0.1 g·mL-1加入樣品抽提緩沖液中充分研磨，將樣品、陽性對照及陰性對照分別加入到酶聯板反應孔中，室溫條件下于黑暗潮濕環境中孵育2 h。具體檢測步驟參照產品說明書。

1.3 ToMMV分子鑒定

1.3.1 引物設計與合成 根據姚玉榮等（2013）、Li等（2014）以及Genbank數據庫中已公布的TMV和ToMMV的基因組全長序列，應用軟件Primer Premier 5.0設計合成3對TMV引物和3對ToMMV引物（表1）。引物由生工生物工程技術（上海）有限公司合成。

1.3.2 總RNA的提取和cDNA的合成 采用天根生化科技（北京）有限公司總RNA提取試劑盒提取每個樣品中的總RNA，利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit對提取的總RNA進行反轉錄。反應體系：RNA模板2.5 μL，RNase Free ddH2O 4.0 μL，5×PrimerScript Buffer 2.0 μL，Random Primer 1.0 μL，PrimerScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL。反應程序：37 ℃，15 min，85 ℃變性20 s，合成的cDNA用于后續PCR擴增反應。

1.3.3 PCR擴增反應 以反轉錄后合成cDNA為模板，采用PCR擴增相應病毒的序列。反應體系：Mix（ 含 Mg2+，dNTP，buffer，Taq 酶 ）12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1.5 μL，ddH2O 9 μL。擴增程序：94 ℃，4 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 個循環；72 ℃，5 min。

表1 用于RT-PCR反應的辣椒病毒引物序列

1.3.4 序列分析 將PCR擴增產物中的特異條帶切膠，采用天根生化科技（北京）有限公司的DNA回收試劑盒純化后與克隆載體PMD19連接，轉化感受態E.coli TOP10，采用PMD19的通用引物對陽性克隆經菌液鑒定后委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。采用生物學軟件DNAMAN進行核苷酸及編碼氨基酸序列的多重比對，系統進化樹的構建采用MEGA 6.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）進行，Bootstrap重復次數為1 000。所用ToMMV參照分離物來源及序列登錄號見表2。

表2 用于序列比對及系統進化分析的ToMMV分離物來源和登錄號

2 結果與分析

2.1 辣椒病毒病發病情況

在甘肅省農業科學院蔬菜研究所育苗棚和試驗地調查發現，辣椒病毒病普遍發生。苗期發病時期可提前至第1片真葉，表現為葉片上卷、畸形，隨著苗齡的增大，癥狀有所緩解，有的植株4～5層新葉表現為健康；定植后，隨著抗性的提高及田間病害防控，病情進一步得到緩解；在采收后期，伴隨蟲害，病毒病發病嚴重，癥狀也復雜多樣，諸如明脈、斑駁、花葉、皺縮、畸形、黃化、壞死和矮化等（圖1）。

2.2 雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測

采用CMV和TMV雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒對采集的辣椒病樣進行檢測，TMV的總檢出率為66.7%，未檢出CMV（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測

2.3.1 TMV擴增結果 采用TMV雙抗體夾心酶聯免疫試劑盒檢測出TMV的陽性率為66.7%，設計3對TMV引物對陽性病樣進行擴增，只有引物TMV1（姚玉榮，2013）在陽性樣品上擴增出了預期大小的條帶，其他2對引物沒有擴增出條帶（圖3）。對擴增出的條帶經回收、純化和克隆、測序（圖4、5），得到536 bp大小的序列片段，通過NCBI BLAST檢索證明與ToMMV（MX5，KF477193）達到97%的序列一致性。

圖1 辣椒病樣病毒病癥狀

圖2 CMV（左）和 TMV（右）的DAS-ELISA檢測

圖3 引物TMV1在辣椒病樣的擴增

圖4 相似目的條帶切膠回收

圖5 陽性克隆的RT-PCR檢測

2.3.2 ToMMV擴增結果 為了進一步確認病毒種類，針對ToMMV（MX5，KF477193）設計3對引物ToMMV1/ToMMVcp/ToMMVspe，ToMMV1擴增的是ToMMV病毒CP基因的部分序列，ToMMVcp擴增的是包括ToMMV病毒CP基因完整序列在內的片段，ToMMVspe擴增的是病毒基因組RNA酶復制區（nt830-1828），3對引物在陽性樣品上都擴增出了預期大小的片段，ToMMV1擴增出的條帶大小為550 bp，ToMMVcp擴增出的條帶大小為850 bp，ToMMVspe擴增出的條帶大小為1 000 bp（圖6），而3對引物在陰性樣品上均未擴增出目的條帶（圖 7）。

圖6 引物TMV2、ToMMV1、ToMMVcp、ToMMVspe在陽性樣品上的RT-PCR擴增

圖7 引物TMV2、ToMMV1、ToMMVcp、ToMMVspe在陰性樣品上的RT-PCR擴增

2.4 ToMMV 的CP基因序列比對及分析

挑選3個分離物，分別命名為Gansu-1、Gansu-2、Gansu-3，對其擴增的完整CP基因核苷酸序列進行分析。結果顯示，核苷酸序列相似性為99.2%～99.6%。將3個分離物與GenBank中已報道的11個ToMMV CP基因（表2）核苷酸序列和氨基酸序列進行比較，核苷酸和氨基酸序列同源性均達到98%以上。

在基于ToMMV CP基因氨基酸的進化樹（圖8）中，本試驗中得到的3個分離物和下載的11個ToMMV CP基因氨基酸可聚為2類，2個來自以色列的ToMMV聚為一類，其余9個ToMMV和分離物Gansu-1、 Gansu-2、Gansu-3聚為一類，其中分離物Gansu-1和來自中國的TiLhaLJ關系較近，分離物Gansu-2和來自美國的S13-5聚為緊密的一族，分離物Gansu-3和來自美國的CA16-01聚為緊密的一族。

圖8 基于ToMMV CP基因氨基酸序列構建的系統發育樹

3 結論與討論

帚狀病毒科（Virgaviridae）煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的成員為棒狀結構，很容易通過植物之間的接觸和機械接種傳播，種子也可傳播病毒。煙草花葉病毒屬有33個種，這33個種在世界范圍內廣泛傳播，其中TMV是第1個被鑒定的（Jacobi et al.，1998；Fillmer et al.，2015）。煙草花葉病毒屬基因組編碼4個蛋白，編碼1個126 kD和1個183 kD復制需要的蛋白，還編碼1個30 kD 的運動蛋白和1個17.5 kD的外殼蛋白（Kumar et al.，2011）。ToMMV是煙草花葉病毒屬中1個新發現的病毒，于2013年首次在墨西哥報道（Li et al.，2013），繼而在美國發現（Webster et al.，2014）。中國于2015年報道在云南、拉薩等地有ToMMV侵染辣椒（Li et al.，2014）。ToMMV侵染辣椒的癥狀為葉片斑駁花葉，皺縮和壞疽。

本試驗對甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗地病毒病病原種類進行了DASELISA鑒定，檢測出TMV的侵染率高達66.7%。為了從分子層面進一步確認TMV病毒，在隨后的RT-PCR擴增中，設計了3對TMV引物，卻只有TMV1在陽性樣品上擴增出了與目的片段大小相似的條帶，其他2對引物沒有擴增出條帶。通過用瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物分離后，選取目的條帶回收后連接到載體上，并轉化感受態大腸桿菌，將陽性克隆測序后經NCBI BLAST檢索證明與ToMMV（MX5，KF477193）序列一致性達到97%。隨后針對ToMMV（MX5，KF477193）進一步設計引物，證明在甘肅省農業科學院蔬菜研究所辣椒育苗棚和試驗地的病毒病病原種類為ToMMV。選取3個分離物CP基因氨基酸序列構建系統進化樹，結果表明其中的2個分離物與來源于中國的2個分離物 YYMLJ（KR824951.1）、TilhaLJ（KR824951.1）關系較近。

本試驗中使用TMV DAS-ELISA檢測試劑盒和試紙條（試驗結果未列出）均在病樣上檢測出陽性結果，但通過RT-PCR技術證明病毒種類為ToMMV，進一步說明煙草花葉病毒屬的成員之間的交叉反應影響DAS-ELISA檢測過程中對病原的準確診斷。

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