食欲素-B抑制大鼠腦缺血再灌注損傷

徐 超，王春梅，白 波*

(1.山東大學 齊魯醫學部，山東 濟南 250012; 2.濟寧醫學院 神經生物學研究所，山東 濟寧 272067)

在4.5 h內靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑(recombiant human tissue type plasminogen activator，rt-PA)是處理急性缺血性腦卒中最有效方式。由于相對嚴格的適應癥及禁忌癥，接受溶栓治療的患者比例較低[1]。在溶栓后，由于細胞內Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性和線粒體功能障礙等，使再灌注后的腦組織發生繼發性損傷，導致患者多數預后不佳[2]。因此，研究能夠減輕腦缺血再灌注損傷的新型藥物很重要。

在大鼠下丘腦腹外側核中首先發現食欲素(orexin)，它主要在攝食、能量代謝和睡眠-覺醒等生理功能中發揮作用。其前體經過剪接修飾產生食欲素-A(OXA)與食欲素-B(OXB)。兩者作用于腦內廣泛分布的受體發揮作用， 食欲素-B可與食欲素1型受體(OX1R)和食欲素2型受體(OX2R)結合[3]。 食欲素-A在發作性睡病、抑郁癥和阿爾茨海默病等疾病中起到神經保護作用[4- 6]。但對食欲素-B的研究相對較少。本實驗在腦缺血再灌注后的大鼠模型，通過側腦室注射食欲素-B，探討食欲素-B在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級Wistar大鼠，雄性，鼠齡7～8周，體質量200～230 g[濟南朋悅實驗動物有限公司，合格證號SCXK(魯)20140007]。

1.1.2 主要試劑：Orexin-B(Phoenix Pharmaceuticals公司)；Orexin receptor 2抗體、AKT抗體、p-AKT抗體、p-GSK- 3β抗體及二抗羊抗鼠和羊抗兔抗體(Cell Signaling Technology公司)； 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2, 3, 5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理：隨機將大鼠分為假手術組(control)、缺血再灌注組(I/R)、缺血再灌注+PBS組(I/R+PBS)和缺血再灌注+orexin-B組(I/R+OXB)。制備大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occulusion，MCAO)模型[7]，進行Zea-Longa 5級神經行為學評分以確定模型是否制備成功，于腦缺血2 h后再灌注24 h。在再灌注早期(20 min)注射10 μL的食欲素-B，其濃度根據預實驗確定為1 μg/μL。

1.2.2 TTC染色檢測腦梗死體積： TTC是一種脂溶性光敏感復合物，常用來檢測哺乳動物組織的缺血梗死狀態。活細胞內的脫氫酶將TTC還原為紅色甲瓚化合物TPF(1,3,5-triphenylformazan)[8]。對于缺血組織，因脫氫酶活力喪失呈現蒼白色，而正常組織呈深紅色。為排除梗死側大腦水腫對計算的影響，采用公式：非梗死側半球面積-梗死側半球正常腦組織面積/非梗死側半球面積×100%，計算半球腦梗死比并評估腦梗死程度。

1.2.3 Western blot檢測大鼠損傷側大腦海馬OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β蛋白表達： 提取損傷側海馬蛋白，根據所測蛋白濃度決定待測樣品上樣體積，進行SDA-PAGE蛋白凝膠電泳和轉膜。經抗體孵育后，加ECL試劑置于凝膠成像儀中顯色并留存圖片，用Image J圖像分析軟件對條帶進行定量分析。

1.2.4 跳臺實驗：模型制作成功后1周，進行大鼠跳臺實驗[9]。本實驗使大鼠在箱內自由適應3 min，共適應3次，間隔30 min。訓練24 h后，記錄動物自放上平臺后至跳下平臺的潛伏期、5 min內跳下平臺的錯誤次數, 此為動物的最終記憶成績。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Orexin-B明顯降低腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積

I/R組較對照組有明顯梗死灶。I/R+OXB組較I/R組和I/R+PBS組，梗死區域面積顯著減小(P<0.05)(圖1)。

A.TTC staining；B.infarct size ratio in different groups；*P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS

2.2 各組大鼠海馬組織OX2R、p-AKT、p-GSK- 3β的蛋白表達

與對照組相比，I/R組海馬中OX2R及p-AKT顯著降低(P<0.05)，而p-GSK- 3β升高(P<0.05)。IR+OXB組上述指標均變化明顯緩解(P<0.05)。(圖2，表1)

圖2 比較大鼠海馬組織中OX2R、p-AKT和pGSK-3β的蛋白表達Fig 2 Comparison of the expression of OX2R, p-AKT, p-GSK- 3βin hippocampus of rats in four groups

2.3 各組大鼠跳臺實驗潛伏期及錯誤次數

I/R組較對照組潛伏期時間縮短，而錯誤次數增多(P<0.05)，而I/R+OXB組上述改變顯著減輕(P<0.05)。

表1 比較4組大鼠海馬OX2R、p-AKT和p-GSK- 3β的蛋白表達變化

△P<0.05 compared with contral;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

表2 4組跳臺實驗潛伏期時間及錯誤次數比較

△P<0.05 compared with control;#P<0.05 compared with I/R and I/R+PBS.

3 討論

GSK- 3β是一種參與糖代謝、細胞增殖和凋亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[10]。在體內它受AKT信號通路調控，當AKT活化后，可磷酸化GSK- 3β的Ser9殘基，從而抑制GSK- 3β的活性，發揮細胞保護作用。有報道食欲素神經元屬于葡萄糖敏感型神經元，血糖較低時，該神經元被刺激而活化[11]。

本實驗采用經典MCAO模型模擬大腦缺血再灌注狀態，并在治療期內側腦室注射食欲素-B，發現食欲素-B治療組腦梗死體積較損傷組明顯減少，表明食欲素-B可以減輕腦缺血再灌注后的損傷；實驗還表明損傷組食欲素受體2的蛋白表達較對照組下調，提示該受體參與損傷過程，治療組較損傷組相比，受體數量升高，表明食欲素-B可抑制腦缺血再灌注損傷。治療組p-AKT蛋白表達升高，p-GSK- 3β蛋白表達下降，表明食欲素-B可能通過活化下游的AKT，增強磷酸化，抑制p-GSK- 3β的活性，繼而抑制糖原合成及促進神經膠質細胞增殖。跳臺實驗，觀察到食欲素-B治療組的潛伏期較損傷組延長，錯誤次數減少，表明治療組大鼠的學習記憶能力較損傷組明顯提升，趨利避害的認知能力得到加強。

綜上，初步證明腦缺血再灌注后食欲素受體增多，參與細胞凋亡，食欲素-B可能通過激活p-AKT,降低下游p-GSK- 3β的活性從而抑制糖原合成，升高腦血管中血糖濃度，抑制神經元凋亡。食欲素-B能提高p-AKT活性，抑制p-GSK- 3β活性，有望成為治療腦缺血再灌注的神經保護藥物，其確切機制有待進一步探討。

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