基于高密度Bin圖譜的水稻抽穗期QTL定位

董驥馳 楊 靖 郭 濤 陳立凱 陳志強(qiáng) 王 慧

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基于高密度Bin圖譜的水稻抽穗期QTL定位

董驥馳**楊 靖**郭 濤 陳立凱 陳志強(qiáng)*王 慧*

華南農(nóng)業(yè)大學(xué) / 國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心, 廣東廣州 510642

以粳稻品種02428和秈稻品種玉針香進(jìn)行雜交, 按單粒傳法連續(xù)自交10代, 得到包含192個(gè)株系的重組自交系(RIL)作圖群體。通過(guò)對(duì)兩親本重測(cè)序及RIL群體簡(jiǎn)化基因組測(cè)序, 構(gòu)建了包含2711個(gè)Bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜。該圖譜各染色體標(biāo)記數(shù)在162~311個(gè)之間, 標(biāo)記間平均物理距離為137.68 kb。將親本及192個(gè)株系分別于4個(gè)環(huán)境下采用隨機(jī)區(qū)組種植, 并記錄抽穗期。使用WinQTL Cartographer 2.5軟件的CIM分析方法, 進(jìn)行抽穗期相關(guān)QTL檢測(cè)及定位。在4個(gè)環(huán)境下定位到影響抽穗期的QTL共14個(gè), 分布于第1、第2、第3、第7、第8、第9和第10染色體。其中,和能在3個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率分別為5.14%~11.15%和5.35%~16.97%, 分別能縮短抽穗期1.66 d和1.56 d, 具有聚合育種的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)物理位置比對(duì), 14個(gè)QTL中有11個(gè)與前人定位在相同或鄰近區(qū)域,和尚未見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)對(duì)詳細(xì)分析, 在其染色體區(qū)間內(nèi)找到3個(gè)與抽穗期相關(guān)的注釋基因、和, 其中已被克隆。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn), 這3個(gè)基因在兩親本間都存在差異, 可作為候選基因。

水稻; 抽穗期; Bin圖譜; QTL定位

水稻抽穗期決定了品種的種植地區(qū)與季節(jié)適應(yīng)性[1], 而且與產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性關(guān)系密切[2], 相關(guān)的研究對(duì)指導(dǎo)育種實(shí)踐、品種改良及品種推廣均具有重要意義[3]。自Yano等克隆了第一個(gè)水稻抽穗期QTL ()以來(lái), 目前至少已有734個(gè)與水稻抽穗期相關(guān)的QTL被報(bào)道(http://www.grammene.org/), 用圖位克隆的方法至少克隆了14個(gè)抽穗期相關(guān)的QTL[4-17]。已有研究表明, 水稻有2個(gè)成花素基因()和(), 以及幾個(gè)抽穗抑制基因(如和), 它們形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)精密控制著抽穗。至少有2個(gè)抽穗期調(diào)節(jié)通路控制著成花素基因表達(dá), 分別是()通路和()通路。大量研究證實(shí), 大多數(shù)抽穗期相關(guān)基因通過(guò)通路或通路來(lái)調(diào)節(jié)成花素基因的表達(dá),和則不同, 它們獨(dú)立于和通路, 直接調(diào)節(jié)成花素基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)抽穗[18]。然而, 已定位和克隆的QTL還并不能完全解釋水稻抽穗期自然變異的形成, 從根本上理解水稻抽穗期的遺傳機(jī)理還需更多的深入研究, 從而更好地幫助適宜生育期品種的選育[19-20]。目前的研究大多基于傳統(tǒng)分子標(biāo)記(如AFLP、RFLP、SSR等), 操作起來(lái)耗時(shí)耗力, 不能實(shí)現(xiàn)高通量操作[21]。用傳統(tǒng)分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜密度低、定位區(qū)間過(guò)大, 導(dǎo)致QTL貢獻(xiàn)率估算偏高、基因克隆困難以及難以開(kāi)發(fā)標(biāo)記應(yīng)用于聚合育種。此外, 標(biāo)記密度低的圖譜上存在大量Gap, 在QTL定位中不能提供足夠的信息, 甚至一些研究最終陷入多態(tài)性分子標(biāo)記缺乏而難以進(jìn)一步定位的境地[22]。本研究中的Bin標(biāo)記分布于整個(gè)基因組, 構(gòu)建的Bin圖譜標(biāo)記密度高、位置精確, 達(dá)到精細(xì)定位要求, 可直接進(jìn)行分子育種標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和候選基因的篩選。本研究以秈稻玉針香(YZX)和粳稻02428衍生的RIL為作圖群體, 采用GBS技術(shù)構(gòu)建包含2711個(gè)Bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜, 分別于4個(gè)環(huán)境對(duì)水稻抽穗期進(jìn)行QTL定位, 以期鑒定一些新的、可穩(wěn)定遺傳的QTL位點(diǎn)作為育種資源, 并為水稻抽穗期調(diào)控基因克隆及分子標(biāo)記輔助育種提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用秈稻玉針香(YZX)和粳稻02428雜交, 通過(guò)單粒傳法, 從F2代開(kāi)始構(gòu)建玉針香/02428的重組自交系群體。群體包含192個(gè)株系, 基因型鑒定為F6世代, 表型調(diào)查為F8~F11世代。

1.2 田間種植與性狀考查

2016年早造(E1環(huán)境)、2016年晚造(E2環(huán)境)、2017年早造(E3環(huán)境)和2017年晚造(E4環(huán)境)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)教學(xué)基地(23.17°N, 113.37°E)種植192個(gè)株系的RIL群體及兩親本。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì), 田間管理(水、肥、病蟲害防治等)按當(dāng)?shù)卮筇锍Ｒ?guī)栽培要求實(shí)施。E1環(huán)境, 于2016年3月5日播種育秧, 4月5日移栽。E2環(huán)境, 于2016年7月25日播種育秧, 8月8日移栽。E3環(huán)境, 于2017年2月28日播種育秧, 3月31日移栽。E4環(huán)境, 于2017年7月22日播種育秧, 8月7日移栽。每個(gè)株系6行, 每行6株, 行株距為20 cm × 20 cm, 均單本種植。

以單株為單位調(diào)查表型, 當(dāng)單株的第1個(gè)稻穗尖露出劍葉葉鞘至少1 cm時(shí), 記為該單株的抽穗日期, 每隔1 d調(diào)查一次。剔除異常數(shù)據(jù)后, 以株系內(nèi)全部單株從播種到抽穗所經(jīng)歷天數(shù)的均值作為該株系的抽穗期表型值。

1.3 DNA提取及高通量測(cè)序

采用本實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的高通量磁珠法制備DNA樣品。用Precellys 24研磨儀(4000′, 12 s)研磨液氮冷凍過(guò)的葉片至粉末, 迅速加入85℃預(yù)熱的LB提取液(200 mmol L–1Tris-HCl (pH 7.8), 250 mmol L–1NaCl, 25 mmol L–1ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2% polyvinylpyrrolidone (PVP)-40), 確保葉片粉末都浸泡在提取液中, 迅速蓋上橡膠蓋并混勻, 置于65℃水浴鍋中水浴20~25 min后, 置–20℃冰箱放置20 min。將樣品轉(zhuǎn)移至96孔深孔板, 每孔加入540 μL異丙醇和2.5 μL磁珠液(100 mg mL–1, 洛陽(yáng)惠爾納米科技有限公司), 用自動(dòng)核酸純化儀KingFisher Flex進(jìn)行DNA分離純化。DNA最終溶于150 μL洗脫液(10 mmol L–1Tris-HCl, 1 mmol L–1EDTA (pH 8.3), 100 μg mL–1RNase A), 于–80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ原傊悄z電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量, Nanodrop ND-1000微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)DNA的濃度與純度[23]。

采用WGS (Whole Genome Sequencing)和GBS (Genotyping-By-Sequencing)技術(shù)分別對(duì)兩親本及其衍生的RIL群體測(cè)序。水稻基因組經(jīng)電子酶切評(píng)估, 選擇酶切片段大小適宜, 酶切位點(diǎn)在基因組上分布均勻, 且能有效降低酶切片段中基因組重復(fù)序列所占比例的限制性內(nèi)切酶?；蚪M加上帶有barcode的接頭后, 對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增, 隨后混合選擇需要的片段構(gòu)建GBS文庫(kù)。利用Illumina HiSeq2500測(cè)序平臺(tái), 進(jìn)行雙末端(Paired-End)測(cè)序。測(cè)序后的數(shù)據(jù)分析流程如下: (1)數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估, 去除接頭、污染序列及低質(zhì)量reads; (2)統(tǒng)計(jì)酶捕獲的Reads數(shù)量; (3)參考基因組(http://plants.ensembl.org/Oryza_ sativa/)比對(duì): 利用BWA軟件(http://bio-bwa.sourceforge. net/)將測(cè)得基因組與參考基因組比對(duì), 統(tǒng)計(jì)比對(duì)率、覆蓋深度、基因組覆蓋率等; (4)群體SNP檢測(cè); (5)遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)?；谟H本SNP檢測(cè)結(jié)果, 開(kāi)發(fā)子代標(biāo)記, 并統(tǒng)計(jì)子代測(cè)序深度、覆蓋度等, 評(píng)估測(cè)序質(zhì)量。與親本玉針香相同的基因型記為“0”, 與親本02428相同的基因型記為“2”, 部分雜合基因型記為“1”。(6)遺傳標(biāo)記過(guò)濾。檢查異常堿基, 檢查基因型缺失覆蓋率并過(guò)濾, 檢查基因型頻率, 過(guò)濾偏分離標(biāo)記。

1.4 遺傳重組鑒定和連鎖圖譜構(gòu)建

采用ScmapV5軟件構(gòu)建遺傳圖譜。構(gòu)建原理是: (1)通過(guò)“滑動(dòng)窗口”法(sliding window approach)尋找交換點(diǎn); (2)將所有樣本中同一段序列上2個(gè)交換點(diǎn)之間緊密連鎖不發(fā)生重組的若干個(gè)SNP位點(diǎn)看做一個(gè)整體區(qū)塊, 即“Bin標(biāo)記”, 以Bin的起點(diǎn)來(lái)確定其所在物理位置; (3)根據(jù)基因型, 用最大似然函數(shù)計(jì)算重組率; (4)用Kosambi作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換為遺傳距離; (5)利用兩點(diǎn)檢驗(yàn)法檢驗(yàn)兩個(gè)標(biāo)記間是否連鎖。(6)通過(guò)最短距離法進(jìn)行聚類分析, 把兩兩連鎖的標(biāo)記聚為一個(gè)類, 得到連鎖群; (7)基于三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)法, 對(duì)連鎖群內(nèi)的標(biāo)記進(jìn)行排序。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

在Microsoft Excel 2010中完成表型數(shù)據(jù)處理和作圖。采用BWA軟件的默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行基因組比對(duì)及相關(guān)測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用WinQTL Cartographer 2.5軟件定位水稻抽穗期QTL, 以LOD=2.5為閾值檢測(cè)QTL; 應(yīng)用CIM算法, 掃描區(qū)間為1.0 cM, 遺傳背景控制選擇標(biāo)準(zhǔn)模型(模型6)。QTL定位結(jié)果以LOD的峰值作為該QTL的LOD值, 以LOD峰值位置的Bin標(biāo)記來(lái)估計(jì)QTL效應(yīng), 以LOD值下降1.0的區(qū)域作為QTL的置信區(qū)間, 遵循McCouch等[24]的原則命名QTL。應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析及計(jì)算。應(yīng)用Origin 8.0進(jìn)行頻次分布圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

親本玉針香和02428重測(cè)序Q20的比例分別為93.72%和94.22%, Q30比例分別為86.44%和87.47%。兩親本測(cè)序Reads與Nipponbare (ssp)參考基因組的比對(duì)率分別為96.29%和97.97%, 平均深度分別達(dá)到20.26×和26.21×, 1×以上覆蓋度為90.60%和96.36%, 4×以上覆蓋度為85.41%和94.53%。兩親本中共發(fā)現(xiàn)1 534 036個(gè)多態(tài)性SNP, 篩選后剩余aa×bb型1 334 454個(gè)。

利用GBS技術(shù)對(duì)192個(gè)RIL株系進(jìn)行測(cè)序, 測(cè)序深度平均值為11.76×, 4×以上覆蓋度為7%。分別提取192個(gè)子代在上述的1 334 454個(gè)親本多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)的基因型, 經(jīng)過(guò)分析和篩選最終共獲得2711個(gè)均勻分布于12條染色體的Bin標(biāo)記。將Bin標(biāo)記錨定于連鎖群后, 各染色體上標(biāo)記數(shù)量為162~311個(gè), 各染色體的平均遺傳距離為195.3 cM, 兩標(biāo)記間遺傳距離平均值為0.86 cM, 兩標(biāo)記間物理距離平均值為137.36 kb, 標(biāo)記整體的分布達(dá)到精細(xì)作圖的要求(圖1)。

2.2 抽穗期表型特征

方差分析表明兩親本抽穗期天數(shù)的均值存在極顯著差異, 4個(gè)環(huán)境下玉針香的抽穗期均顯著長(zhǎng)于02428 (表1)。

表2表明, 在E1環(huán)境中, RIL群體抽穗期的平均值為95.65 d, 抽穗期最短的株系為81.33 d, 抽穗期最長(zhǎng)的株系為117.83 d; 在E2環(huán)境中, RIL群體抽穗期的平均值為69.15 d, 抽穗期最短的株系為53.13 d, 抽穗期最長(zhǎng)的株系為85.4 d; 在E3環(huán)境中, RIL群體抽穗期的平均值為95.29 d, 抽穗期最短的株系為81 d, 抽穗期最長(zhǎng)的株系為110.3 d; 在E4環(huán)境中, RIL群體抽穗期的平均值為70.54 d, 抽穗期最短的株系為61.3 d, 抽穗期最長(zhǎng)的株系為87.5 d; 四個(gè)環(huán)境中RIL群體的抽穗期峰度和偏度絕對(duì)值都小于1, 總體呈正態(tài)分布(圖2), 表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳模式。

2.3 抽穗期QTL定位

在4個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到14個(gè)抽穗期QTL(表3和圖1)。其中, E1環(huán)境中檢測(cè)到9個(gè), 分布于第2、第3、第7、第8和第10染色體, LOD值介于2.9~5.6之間, 貢獻(xiàn)率介于4.7%~9.5%之間; E2環(huán)境中檢測(cè)到5個(gè), 分布于第2、第7和第10染色體, LOD值介于3.0~5.0之間, 貢獻(xiàn)率介于5.2%~9.5%之間; E3環(huán)境中檢測(cè)到3個(gè), 分布于第1、第2和第8染色體, LOD值介于2.5~5.9之間, 貢獻(xiàn)率介于4.5%~11.2%之間; E4環(huán)境中檢測(cè)到5個(gè), 分布于第3、第9和第10染色體, LOD值介于2.8~9.6之間, 貢獻(xiàn)率介于4.6%~17.0%之間。其中, 有2個(gè)QTL在3個(gè)環(huán)境中均檢測(cè)到。

圖1 遺傳標(biāo)記在染色體上的分布及QTL位置

每條染色體上的黑色線條代表Bin標(biāo)記所在位置; 紅色字體為已克隆QTL; 藍(lán)色字體為新發(fā)現(xiàn)的QTL。

Black lines represent the positions of Bin markers on each linkage group; fonts in red are cloned QTLs; fonts in blue are novel QTLs.

表1 02428與玉針香抽穗期天數(shù)比較

**表示差異在0.01水平達(dá)到極顯著。

**indicates significant difference at the 0.01 probability level.

表2 RIL群體抽穗期性狀表現(xiàn)

圖2 玉針香/02428重組自交系及親本的抽穗期表型分布特征

在第1染色體上, 僅在E3環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于160.17 cM, 與mk186連鎖。其LOD值為2.5, 置信區(qū)間為25.95~26.05 Mb, 表型貢獻(xiàn)率為4.5%, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短生育期1.3 d。

位于第2染色體, 僅在E2環(huán)境中被檢測(cè)到, 在173.61 cM LOD達(dá)到峰值3.2, 與mk484緊密連鎖, 置信區(qū)間為17.60~28.35 Mb, 能解釋5.8%的表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.3 d。同一染色體上的在3個(gè)環(huán)境中均被檢測(cè)到, 表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在E1環(huán)境檢測(cè)到的位置是178.21 cM, LOD值為3.1, 置信區(qū)間為28.25~28.65 Mb, 可解釋5.1%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.5 d; 在E2環(huán)境檢測(cè)到的位置是179.71 cM, LOD值為5.0, 置信區(qū)間為28.45~28.65 Mb, 可解釋9.5%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.6 d。在E3環(huán)境檢測(cè)到的位置是175.19 cM, LOD值為5.9, 置信區(qū)間為28.15~28.65 Mb, 可解釋11.2%的表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.9 d。

第3染色體上共有3個(gè)抽穗期QTL, 分別為和。在E1環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于194.21 cM處, LOD值為2.9, 置信區(qū)間為30.05~30.65 Mb, 可解釋4.7%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.4 d; 在E4環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于197.3 cM處, LOD值為3.4, 置信區(qū)間為30.45~31.05 Mb, 可解釋5.6%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.0 d。在E1環(huán)境被檢測(cè)到, 位于205.11 cM處, LOD值為3.2, 置信區(qū)間為31.85~32.45 Mb, 可解釋5.25%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.5 d; 在E4環(huán)境被檢測(cè)到, 位于205.11 cM處, LOD值為3.0, 置信區(qū)間為31.85~32.45 Mb, 可解釋4.85%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.0 d。僅在E1環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于211.21 cM處, LOD值為3.2, 置信區(qū)間為33.10~33.55 Mb, 可解釋5.3%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.5 d。

第7染色體上共有2個(gè)抽穗期QTL。只在E1環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于48.81 cM處, 與mk1681緊密連鎖, LOD值為4.2, 置信區(qū)間為8.65~8.85 Mb, 可解釋7.0%的表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可推遲抽穗期1.7 d。只在E2環(huán)境中被檢測(cè)到, 位于118.41 cM處, 與mk1725緊密連鎖, LOD值為3.0, 置信區(qū)間為22.05~22.55 Mb, 可解釋5.2%的表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.2 d。第8染色體上共有2個(gè)抽穗期QTL, 即和。在E1環(huán)境檢測(cè)到的位置是42.41 cM, 與mk1823緊密連鎖, LOD值為5.6, 置信區(qū)間為4.20~4.55 Mb, 可解釋9.5%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因能推遲抽穗期2 d; 在E3環(huán)境檢測(cè)到的位置是42.44 cM, 與mk1823緊密連鎖, LOD值為3.9, 置信區(qū)間為4.20~4.55 Mb, 可解釋7.5%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因能推遲抽穗期2.4 d。僅在E1環(huán)境被檢測(cè)到, 位于56.71 cM處, 與mk1830緊密連鎖, LOD值為4.3, 置信區(qū)間為4.65~5.15 Mb, 可解釋7.4%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因能推遲抽穗期1.7 d。

在第9染色體上125.4 cM處, 僅在E4環(huán)境中被檢測(cè)到, 與mk2090連鎖。其LOD值為2.8, 置信區(qū)間為16.55~16.75 Mb, 表型貢獻(xiàn)率為4.6%, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短生育期1.0 d。

第10染色體56.71 cM處為, 僅在E1環(huán)境被檢測(cè)到, 它與mk2245緊密連鎖, LOD值為3.5, 置信區(qū)間為16.35~16.65 Mb, 可解釋6.7%表型變異, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.6 d。同一染色體上的在E1、E2和E4環(huán)境被重復(fù)檢測(cè)到, 置信區(qū)間為16.75~17.25 Mb, E1環(huán)境的LOD值為4.5, 貢獻(xiàn)率為8.2%, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.4 d; E2環(huán)境的LOD值為3.2, 貢獻(xiàn)率為5.4%, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.5 d; E4環(huán)境的LOD值為9.6, 貢獻(xiàn)率為17.0%, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.7 d。第10染色體67.41 cM處是, 僅在E2環(huán)境中被檢測(cè)到, LOD值為4.2, 可解釋7.5%表型變異, 置信區(qū)間為17.75~17.95 Mb, 來(lái)自于02428的等位基因可縮短抽穗期1.4 d。

2.4 注釋基因篩選

在3個(gè)環(huán)境中可重復(fù)檢測(cè)到, 其置信區(qū)間最大時(shí)為28.15~28.65 Mb, 在該染色體區(qū)間有33個(gè)注釋基因(The Rice Annotation Project Database), 逐一篩除發(fā)現(xiàn)有3個(gè)位點(diǎn)很可能影響抽穗期, 分別是、和其中,與擬南芥中()同源, 可影響水稻抽穗期、胚的發(fā)育及小花器官數(shù)目。和的基因產(chǎn)物是可表達(dá)的蛋白, 其涉及的生物學(xué)進(jìn)程包括花器官的發(fā)育、生殖生長(zhǎng)等。

DNA雙向測(cè)序發(fā)現(xiàn), 玉針香和02428的3個(gè)候選基因間均有序列差異(圖3)。玉針香與02428的基因存在23處堿基差異, 共18處為單堿基的轉(zhuǎn)換, 5處為3堿基以內(nèi)的插入缺失; 其中7處在CDS區(qū)變異, 有5處發(fā)生錯(cuò)義突變, 分別位于CDS+830 bp (TTT/TCT)、CDS+1008 bp (GAG/GAT)、CDS+150 bp (TTG/TTT)、CDS+2413 bp (CGT/TGT)和CDS+2 418 bp (GAC/GAG)。玉針香與02428的基因存在23處堿基差異, 其中21處為單堿基的轉(zhuǎn)換, 2處為單堿基插入缺失; 其中2處在CDS區(qū)的變異, 有1處為錯(cuò)義突變, 位置是CDS+394 bp (AAT/TAT)。玉針香與02428的基因存在13處堿基差異, 其中9處為單堿基的轉(zhuǎn)換, 4處為插入缺失; 其中2處在CDS區(qū)變異, 有1處為錯(cuò)義突變, 位置是CDS+883 bp (CTT/TTT)。同時(shí), 測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn), 02428中3個(gè)候選基因的CDS序列與日本晴參考序列完全相同。

除此之外, 還在其他QTL的置信區(qū)間內(nèi)找到一些與抽穗期相關(guān)可能性較大的注釋基因, 它們都涉及到花的發(fā)育過(guò)程(表4)。

表3 4個(gè)環(huán)境下檢測(cè)到的抽穗期QTL

1)指來(lái)自于02428的等位基因造成的加性效應(yīng), 正值為延長(zhǎng)抽穗期, 負(fù)值為縮短抽穗期。

1)Additive effect from 02428’s allele. Positive (negative) values mean increasing (decreasing) heading date.

表4 QTL置信區(qū)間內(nèi)注釋基因篩選

1)Source: CHINA RICE DATA CENTER and The Rice Annotation Project Database.

圖3 玉針香與02428之間候選基因的結(jié)構(gòu)和變異

A:; B:; C:。黑色框: 外顯子; 灰色部分: 編碼序列; 紅色箭頭: SNP; 帶黑點(diǎn)紅色箭頭: 錯(cuò)義突變; 藍(lán)色箭頭: 插入缺失。

A:; B:; C:Frames with black lines: exon; Grey boxes: protein coding sequence; Red arrow: SNP; Red arrow with a black point: missense mutation; Blue arrow: InDel.

3 討論

3.1 采用Bin圖譜定位QTL的優(yōu)勢(shì)

目前大多數(shù)研究者采用傳統(tǒng)分子標(biāo)記(如SSR、RFLP等)構(gòu)建遺傳圖譜[25], 精度約為1~10 Mb, 存在標(biāo)記數(shù)量少且分布不均勻的問(wèn)題, 影響了QTL定位的精確度, 另外標(biāo)記密度較小還可能導(dǎo)致某些雙交換位點(diǎn)的漏測(cè)[26]。Bin圖譜與傳統(tǒng)的遺傳圖譜相比, 標(biāo)記密度高, 精度達(dá)100 kb, 且一個(gè)Bin內(nèi)部包含多個(gè)不發(fā)生重組的SNP, 因而雙交換能夠被精確檢測(cè)。同時(shí), Bin圖譜是基于測(cè)序技術(shù)構(gòu)建的, 能提供準(zhǔn)確的物理位置, 可使遺傳分析和QTL定位更準(zhǔn)確。此外, 測(cè)序分型得到的大量SNP標(biāo)記可快速應(yīng)用于分子育種。本研究采用GBS技術(shù)構(gòu)建了以SNP為基礎(chǔ)的高分辨率Bin圖譜, 包含2711個(gè)Bin標(biāo)記, 標(biāo)記間平均物理距離137.36 kb, 標(biāo)記整體的分布達(dá)到精細(xì)作圖的密度, 可直接從定位區(qū)間篩選候選基因。另外, 定位結(jié)果顯示, 在LOD值超過(guò)閾值的一段區(qū)域一般存在多個(gè)峰值, 可定位到多個(gè)QTL, 如位置相鄰的和以及和等, 說(shuō)明Bin圖譜對(duì)QTL的檢測(cè)更精細(xì), 可將位置相鄰的QTL有效地分離、解析。

3.2 本研究與前人定位QTL的比較

本研究定位的在第1染色體上, 僅在E3環(huán)境中被檢測(cè)到, 其LOD值為2.5, 置信區(qū)間為25.95~26.05 Mb, 表型貢獻(xiàn)率為4.5%, 在前人的研究中未見(jiàn)報(bào)道。

位于第2染色體27.95 Mb處, 置信區(qū)間為17.60~28.35 Mb, 表型貢獻(xiàn)率為5.8%, LOD值為3.2, 在該區(qū)間有多篇相關(guān)的報(bào)道[27-32], 其中Thomson等[31]報(bào)道的表型貢獻(xiàn)率為4.4%, LOD為4.06, 在5個(gè)環(huán)境中檢測(cè)到1次, 與位置也最近, 它們可能為同一QTL。在第2染色體上, E1環(huán)境于28.55 Mb位置檢測(cè)到1個(gè)QTL, 其置信區(qū)間為28.25~28.65 Mb; E2環(huán)境于28.65 Mb位置檢測(cè)到1個(gè)QTL, 置信區(qū)間為28.45~28.65 Mb; E3環(huán)境于28.35 Mb位置檢測(cè)到1個(gè)QTL, 置信區(qū)間為28.15~28.65 Mb。這3個(gè)QTL位置十分相近, 置信區(qū)間十分相似, 因此視為同一QTL, 命名為, 它在前人的研究中未見(jiàn)報(bào)道, 很可能是與水稻抽穗期相關(guān)的新位點(diǎn)。

第3染色體上檢測(cè)到3個(gè)QTL和。在2個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到, 在E1環(huán)境定位的位置是30.55 Mb, 置信區(qū)間分別為30.55~30.65 Mb; E4環(huán)境定位的位置是30.95 Mb, 置信區(qū)間為30.45~31.05 Mb。也在2個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到, 定位的位置是32.35 Mb, 置信區(qū)間為31.85~32.45 Mb。僅在E1環(huán)境被檢測(cè)到, 位于33.35 Mb, 置信區(qū)間為33.10~ 33.55 Mb。這3個(gè)QTL所在區(qū)域已有相關(guān)報(bào)道[31,33-34]。

位于第7染色體8.85 Mb處, 置信區(qū)間為8.65~8.85 Mb, 已精細(xì)定位的包含了該區(qū)間[35]。同一染色體上的位于22.35 Mb處, 置信區(qū)間為22.05~22.55 Mb, 該區(qū)間位于Thomson等[31]定位的所在區(qū)間RM125–RM336內(nèi)部, Jiang等[36]定位的與的區(qū)間也有部分重疊。

位于第8染色體4.45 Mb處, 置信區(qū)間為4.20~ 4.55 Mb, 與已克隆的[39]位置相吻合, 都表現(xiàn)為長(zhǎng)日照延長(zhǎng)抽穗期。位于第8染色體5.15 Mb處, 置信區(qū)間為4.65~5.15 Mb, 在該區(qū)段也有多個(gè)相關(guān)報(bào)道[37-40]。

僅在E4環(huán)境被檢測(cè)到, 位于第9染色體16.75 Mb處, 與mk2090緊密連鎖, 置信區(qū)間為16.55~16.75 Mb,未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

位于第10染色體16.45 Mb處, 置信區(qū)間為16.35~16.65 Mb, 與Thomson等[31]定位的區(qū)間有部分相重疊。在第10染色體上, E1環(huán)境于17.25 Mb位置檢測(cè)到1個(gè)QTL, 其置信區(qū)間為16.75~17.25 Mb; E2環(huán)境于16.75 Mb位置檢測(cè)到1個(gè)QTL, 置信區(qū)間為16.75~ 17.25 Mb。這2個(gè)QTL位置相近、區(qū)間相同, 因此視為同一QTL, 命名為, Doi等[7]報(bào)道的的位置在其區(qū)間內(nèi)。同在第10染色體上的位于17.85 Mb處, 置信區(qū)間為17.75~17.95 Mb, Mei等[32]報(bào)道了與抽穗期相關(guān)的RG241a–CDO98染色體區(qū)段在的區(qū)間內(nèi), Zhou等[28]報(bào)道的與區(qū)間基本相同。

3.3 檢測(cè)到的QTL應(yīng)用價(jià)值及研究?jī)r(jià)值

本研究在4個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到14個(gè)影響抽穗期的QTL, 分布于第1、第2、第3、第7、第8、第9和第10染色體上。除、、、和能在2個(gè)及以上環(huán)境被檢測(cè)到外, 其他QTL只在單個(gè)環(huán)境被檢測(cè)到。其中,和所在的位置分別是克隆基因和。

Hori等[20]同時(shí)用12個(gè)群體進(jìn)行抽穗期相關(guān)的QTL定位, 在其中3個(gè)群體中能檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率為7.9%~74.0%; 在其中2個(gè)群體中能檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率為18.2%~18.3%。Cheng等[2]同時(shí)用3個(gè)群體進(jìn)行抽穗期相關(guān)的QTL定位, 在其中1個(gè)群體中能檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率為3.5%; 在3個(gè)群體中均能檢測(cè)到, 表型貢獻(xiàn)率為3.6%~33.7%。而本研究中檢測(cè)到的表型貢獻(xiàn)率為7.5%~9.5%;的表型貢獻(xiàn)率為5.4%~ 17.0%。這些研究表明, 對(duì)于不同群體, 由于材料遺傳背景影響, QTL貢獻(xiàn)率的變化很大; 其次, 圖譜的精度對(duì)QTL貢獻(xiàn)率的估算影響也較大, 傳統(tǒng)分子標(biāo)記構(gòu)建的圖譜精度通常約為4 Mb, 兩標(biāo)記之間經(jīng)常會(huì)存在多個(gè)相關(guān)基因或QTL簇, 粗定位到的QTL貢獻(xiàn)率會(huì)較高。因此我們認(rèn)為, 重點(diǎn)關(guān)注QTL在不同環(huán)境或不同群體中的重復(fù)定位情況對(duì)聚合育種的意義更大。

和在定位到的QTL中表型貢獻(xiàn)率相對(duì)較小, 表達(dá)也較不穩(wěn)定, 只能2次被重復(fù)檢測(cè)到, 因而利用的可能性小。在兩年的早造中被重復(fù)檢測(cè)到, 僅在早造環(huán)境特異表達(dá), 表現(xiàn)為延長(zhǎng)生育期, 這些都與在長(zhǎng)日條件下延長(zhǎng)抽穗期的特性相對(duì)應(yīng), 它對(duì)于將早熟品種改良成半晚熟的高產(chǎn)品種具有一定價(jià)值。和都能在3個(gè)環(huán)境中被重復(fù)檢測(cè)到, 且都能夠縮短生育期, 說(shuō)明它們受環(huán)境影響較小、表達(dá)較穩(wěn)定, 對(duì)光照和溫度變化不敏感, 它們的表型貢獻(xiàn)率最低時(shí)分別為5.1%和5.4%, 表型貢獻(xiàn)率最高時(shí)分別為11.2%和17.0%, 因此對(duì)于QTL聚合改良品種生育期具有重要價(jià)值。

此外,的置信區(qū)間在3次定位中略有變化, 在E2環(huán)境判定的置信區(qū)間較其他2個(gè)環(huán)境中小,不在此置信區(qū)間內(nèi), 但此時(shí)對(duì)表型的貢獻(xiàn)率仍然達(dá)到9.5%。因此和更有可能是導(dǎo)致抽穗期表型變異的新QTL, 具體情況還需深入研究。

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QTL Mapping for Heading Date in Rice Using High-density Bin Map

DONG Ji-Chi**, YANG Jing**, GUO Tao, CHEN Li-Kai, CHEN Zhi-Qiang*, and WANG Hui*

National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding / South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China

A recombination inbred lines (RIL) population including 192 lines derived from an inter-subspecific cross betweenrice ‘Yuzhenxiang’ andrice ‘02428’ was used in the experiment. The two parent varieties and RIL population were separately sequenced by Whole Genome Sequencing (WGS) and Genotyping-By-Sequencing (GBS) to construct a genetic linkage map with 2711 recombination Bin markers. The number of markers on 12 chromosomes ranged from 162 to 311, and the average physical distance between two markers was 137.68 kb. The WinQTL Cartographer 2.5 was used to analysis QTLs associated with heading date in four different environments. A total of 14 QTLs associated with heading date were detected on chromosomes 1, 2, 3, 7, 8, 9, and 10. Among them,and, which explained 5.14%-11.15% and 5.35%-16.97% of the total phenotypic variation for heading date separately, could be detected in three environments and shorting heading date about 1.66 days and 1.56 days on average. Thetwo QTLs could inherit stablely, having a good potential to be applied in QTL pyramiding. After comparing the physical positions of these QTLs with those previously reported, we found 11 QTLs were located in the same or near position, among them,,andwere newly reported. Furthermore, we found one cloned geneand two annotated genesandin the genomic region of, might be related to heading date. DNA sequence comparison between YZX and 02428 revealed that all the three genes could be candidate genes.

rice; heading date; Bin map; QTL mapping

2017-12-14;

2018-03-25;

2018-04-16.

10.3724/SP.J.1006.2018.00938

王慧, E-mail: wanghui@scau.edu.cn; 陳志強(qiáng), E-mail: chenlin@scau.edu.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

董驥馳, E-mail: Johnkeatsno.1@gmail.com; 楊靖, E-mail: 1349643559@qq.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180416.0843.004.html

本研究由國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-01-12), 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0102102)和廣東省應(yīng)用型研發(fā)項(xiàng)目(2015B020231011)資助。

This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-01-12), the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0102102), and the Research and Development Program for Application in Guangdong Province (2015B020231011).