乙型肝炎病毒核酸免提取熒光定量PCR方法應(yīng)用研究

高潔嚴 敏付婷 邵中軍

【摘要】目的：應(yīng)用免提取熒光定量PCR方法檢測乙型肝炎病毒核酸的含量，以研究分析熒光定量PCR方法在乙型肝炎疾病中的防治、確診、治療康復(fù)及分析病況等的醫(yī)療價值。方法：隨機將研究數(shù)據(jù)分成A、B、C 3個小組，采用酶聯(lián)免疫一吸附劑測定（ELISA法）與聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR法）對乙型肝炎病毒核酸的含量水平進行測定。第1組記為A組：HBsAg（陽性）、HBeAg（陽性）、HBcAb（陽性）的患者。第2組記為B組：HBsAg（陽性）、HBeAb（陽性）、HBcAb（陽性）的患者，第3組記為C組：HBsAg（陽性）、HBcAb（陽性）的患者，組間進行乙型肝炎病毒核酸的陽性率及乙型肝炎病毒核酸含量的t檢驗。結(jié)果：A組患者乙型肝炎病毒核酸的陽性率為100%，明顯高于B組和C組的乙型肝炎病毒核酸的陽性率，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。HBV-DNA平均含量為7.5×1 08copy/mL。B組患者的乙型肝炎病毒核酸的陽性率低于A組的乙型肝炎病毒核酸的陽性率，A組、B組之間的乙型肝炎病毒核酸的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；但平均HBV-DNA含量為9.5×l07copy/mL，與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。c組患者的乙型肝炎病毒核酸的陽性率為51. 83%，與A組的乙型肝炎病毒核酸的陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但與B組的乙型肝炎病毒核酸的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0 5），患者的HBV-DNA含量為7.7×l07copy/mL，與第A、B組的乙型肝炎病毒核酸的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.0 5）。結(jié)論：免提取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR法）所測的乙型肝炎病毒核酸的陽性率比酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA法）結(jié)果效果更好，在臨床中靈敏度高，具有一定的特異性，能夠精準的反映出乙型肝炎患者體內(nèi)核酸的復(fù)制狀況，在臨床上對于研制抵抗病毒的藥物以及對于高效的選出最佳的抗病毒藥物，并且在患者的康復(fù)以及預(yù)后都具有良好的臨床應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；核酸；免提取熒光定量PCR檢測法；ELISA法

乙型肝炎病毒（HBV）簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，是乙型肝炎的病原體，對人和猩猩具有極強易感性，且增長率逐年增加，HBV是目前己知的感染人的最小的DNA病毒之一，也是最難治愈的病毒之一，它長期潛伏在細胞核中，具有很強的隱蔽性，即使抗病毒治療也很難完整清除，一旦患者長期使用免疫抑制劑或化療、放療將導(dǎo)致機體免疫力低下。HBV感染人體是一個連續(xù)、動態(tài)的過程，常用的酶聯(lián)免疫一吸附劑測定（ELISA法）檢測免疫標(biāo)志物可以顯示病毒的復(fù)制狀態(tài)，但其局限性也非常明顯，而免提取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR法）對于乙型肝炎病毒核酸含量水平的檢測過程可將HBV復(fù)制過程直接體現(xiàn)出來，該方法在敏感性和特異性方面表現(xiàn)突出。本文通過對乙肝患者血清中的病毒核酸進行研究以期找到其與免疫標(biāo)志物的相關(guān)性進而為HBV-DNA檢測在乙型肝炎早期診斷、傳染性識別、病毒復(fù)制及臨床治療效果中提供以參考。

1 材料與方法

1.1 一般資料

樣本來源：從2015年乙肝防治示范區(qū)的乙型肝炎患者中選取255例，以上255名患者對本次樣本實驗知情并自愿參加。

1.2 試劑與方法

（1）以免提取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR法）對乙型肝炎病毒核酸進行檢測，試劑盒從蘇州科銘生物技術(shù)有限公司采購，擴增儀型號為ProFlex，檢測方法以試劑盒說明書為準并嚴格執(zhí)行操作，按照常規(guī)方法提取患者血清HBV_DNA[3]。

（2）乙型肝炎免疫標(biāo)志物采用采用酶聯(lián)免疫一吸附劑測定（ELISA法）法進行檢測，試劑盒從北京萬泰生物藥業(yè)有限公司采購，酶標(biāo)儀型號為HBS1096B，檢測方法以試劑盒說明書為準并嚴格執(zhí)行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

對所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.O進行統(tǒng)計和分析。計量資料以（x±s）進行描述，以t檢驗為檢驗水準；計數(shù)資料記為（%），組間比較以X2檢驗。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2 結(jié)果

HBV-DNA的檢測情況（見表1）。

3 討論

乙型病毒性肝炎（ viral hepatitis type B）是由乙型肝炎病毒引起的以肝臟病變?yōu)橹鞯囊环N傳染疾病，臨床上常出現(xiàn)食欲減退、惡心、嘔吐、上腹部不適、肝區(qū)疼痛、乏力等主要表現(xiàn)，部分患者還伴有黃疸發(fā)熱、肝功能損傷等，有些患者甚至?xí)l(fā)展成肝硬化、肝癌等危及生命。臨床醫(yī)務(wù)工作者為了能夠減少乙型病毒性肝炎的發(fā)病率同時也為了能夠提高疾病的治療效果，他們以此為研究目的，通過對乙型肝炎病毒核酸陽性率的測定以及平均含量的測量來提高臨床工作效率。

本次研究中發(fā)現(xiàn)A組患者血清中檢測出乙型肝炎病毒核酸的平均含量為7.5xl08copy/mL（陽性率為100%），同時也反映了乙型肝炎病的核酸免提取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)PCR定量檢測結(jié)果有著相對較高的陽性率，可將HBV的復(fù)制過程更為直觀的體現(xiàn)出來。而對B組128例患者的血清中對HBV-DNA檢測結(jié)果顯示其平均含量為9.5×l07copy/mL（陽性率為52.4%），可明顯看出B組較A組陽性率顯著減低，同時乙型肝炎病毒核酸的平均含量與A組差異度也較明顯（P<0.05），這表明與ELISA模式相比，HBV-DNA所具有的特異性和敏感性均較高，C組32例患者中對HBV-DNA檢測結(jié)果顯示其平均含量為7.7xl07copy/mL（陽性率為51.8%），說明不能僅以ELISA法的結(jié)果（陰性）就判定體內(nèi)乙型病毒性肝炎不發(fā)生復(fù)制，而PCR對于HBV-DNA的含量的檢測能夠?qū)BV復(fù)制狀況更精準的判斷進而提供給臨床更好的服務(wù)。另外，在實際診斷中不能片面的將乙型病毒性肝炎的傳染性及病情嚴重程度用HBV-DNA的含量去描述（二者不呈正相關(guān)），它也不是對治療效果進行判斷的“金指標(biāo)”，臨床醫(yī)務(wù)工作者也應(yīng)該清醒地認識到這一點。而以PCR法對HBV-DNA的定量檢測增添了對體內(nèi)HBV變化的了解的一類新方法，其可將乙型肝炎免疫標(biāo)志物（兩對半）檢測的不足有效彌補。

綜上所述，免提取熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR法）檢測較酶聯(lián)免疫一吸附劑測定（ELISA法）檢測法有更好準確性，能準確反映HBV在體內(nèi)的復(fù)制情況，有效的提高了實驗的效率，可以得到更加真實可靠的結(jié)果，此種方法值得在臨床中推薦使用。