細胞三維培養與傳統細胞培養的應用現狀

江楊帆 何素冰 吳納新 蔡 標 刁慧敏 戴陳偉 辛及娣

細胞技術作為醫學生物技術中最核心、最基礎的技術[1-2]，已成為當今醫學科研工作的必備技能，廣泛應用于生命科學的眾多領域，與其他學科領域的交叉研究也日趨增多[3-4]。傳統細胞培養通常為細胞生長在單層二維的玻璃或塑料平面上，屬于二維培養，具有較好的伸展性，但不能充分真實模擬體內生長模式，最終影響細胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表達等細胞過程。與二維培養系統相比，三維細胞培養系統能更準確地反映細胞在組織中的實際微環境，但三維細胞因為細胞呈現出層疊狀而不能有效地使光穿過，導致細胞觀察與二維細胞培養中的可視化存在明顯差異，故三維細胞模型的檢測在成像、分析、定量和自動化方面遠不如傳統細胞模型方便，有待于技術的進一步發展提高。兩種培養系統存在各自的優點和不足，現將細胞三維培養與傳統細胞培養技術研究應用現狀作如下綜述，以期為細胞培養的選擇提供依據。

1 細胞三維培養及其優缺點

三維細胞培養技術(three-dimensional cell culture, TDCC)是將細胞放置在模仿體內細胞環境的三維培養載體內進行體外培養, 細胞在三維載體的立體空間結構中生長, 構成三維的細胞載體復合物[5]。相較于傳統的二維單層細胞培養，TDCC能更好地模擬體內條件，能更緊密地模仿復雜的細胞組織間相互作用以及在體內的微環境，為細胞的最佳生長、分化提供了一個合適的微環境，并有在體外創造組織樣結構的能力。通過允許單個細胞維持其正常的三維形狀，有助于細胞與相鄰細胞間形成復雜的相互作用和信號接收及發送，為不同類型的細胞培養創造一個更自然的生長環境。

2 傳統細胞培養及其優缺點

傳統細胞培養指細胞浸入到培養液中在普通的玻璃或塑料培養瓶、培養皿及培養板的表面生長，并且只會沿著二維平面延伸，故傳統細胞培養為二維細胞培養模式。

離體組織細胞可通過傳統細胞培養在體外進行生長繁殖，在較簡單的條件下就能長時間直接觀察，研究內容也便于通過倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀、免疫組化等技術來檢測并記錄結果。傳統細胞培養因其研究費用較低，而且可以提供大量生物性狀相似的實驗對象，廣泛應用于細胞生物學、組織胚胎學、藥理學、腫瘤學、免疫學等學科。

雖然體外的細胞比體內細胞的代謝可能更恒定，但是，體外培養的環境與體內的環境不完全相同，缺乏體內的動態平衡。因此，細胞的生長更趨于單一化，其細胞形態和功能可能會發生一定程度的改變，所以體外傳統培養的細胞無法與體內的細胞完全等同，隨著TDCC的逐步突破并日趨成熟完善，傳統細胞培養向TDCC的轉變將成為未來的發展趨勢。

3 細胞三維培養與傳統細胞培養應用比較

3.1 腫瘤研究應用 動物模型是腫瘤研究的重要工具，可監測腫瘤藥物的生物利用度、治療效果和劑量限制毒性等。然而，動物模型因具有成本較高、物種差異等不足，在腫瘤研究中的倫理問題存在較大爭議。體外細胞三維培養模型能較真實地模擬體內環境，它的使用可以減少用于腫瘤研究和藥物評價的動物數量[6]。

在腫瘤藥物篩選中，自然真實的三維環境將有助于更有效識別殺死癌癥的藥物或對正常細胞潛在危險的藥物。此外，腫瘤的侵襲和血管生成等復雜過程，同樣可以使用三維模式來進行模擬。三維模型也被應用于腫瘤抑制作用及其相關機制的研究，如缺氧誘導的耐藥性[7]、轉移樣侵襲和癌細胞擴散[8]和癌相關的成纖維細胞浸潤[9]等。

總之，腫瘤生物學的研究主要是基于體外實驗細胞系，而TDCC能更好地代表組織結構和細胞微環境，三維癌癥模型主要目標是縮小二維細胞系、動物模型和臨床研究之間的差距。因此，通過開發先進三維細胞培養的體外模型，能夠更加真實模擬體內腫瘤微環境[10-11]。

3.2 藥物藥理研究應用 篩選藥物的標準程序包括在臨床前和臨床階段對新的候選藥物進行全面評價，許多藥物在臨床實驗階段失敗，為了降低成本，最好在動物實驗之前盡早排除有毒化合物，因此，以細胞為基礎的分析技術通常是藥物發現過程的一個關鍵的部分，它提供了一種簡單快速，成本效益高的工具，避免了大規模和高成本的動物實驗[12-13]。研究人員常通過細胞培養來觀察不同藥物對離體細胞的作用，從而為藥物的藥效作用提供實驗依據以及臨床實際使用參考，與傳統二維模式相比，三維培養方式與觀察到的生理條件更加密切相關、更為真實，更好地預測了體內藥物處理，能夠嚴格預測人類藥物作用和安全性[14]。Nata?a等[15]通過細胞三維模型比較已知化療藥物的輻射增敏效應，結果顯示，在有效治療濃度范圍內，三維模型對于篩選新化合物更加高效。綜上所述，TDCC在早期藥物發現中將有廣泛應用，如疾病建模、目標識別和驗證、篩選、藥物療效和安全評估等。

三維細胞培養還有望成為抗病毒藥物體外研究的理想工具，Koban等[16]通過對人表皮角質形成細胞NHEK三維培養和單層培養的比較來分析吉非替尼的抗病毒療效，結果顯示，吉非替尼在三維培養中細胞增殖和病毒復制顯著降低，比傳統單層培養低100倍，大大降低了細胞毒性水平。故三維培養因更準確模擬體內生理環境而有助于理解病毒與宿主之間的相互作用及機制，促進抗病毒藥物的發展，從而在預防、診斷和治療新型病毒性疾病具有巨大潛力。

3.3 干細胞研究應用 干細胞在組織工程和再生醫學中的應用不可或缺，特別是對于成功修復長期自我更新的組織，如皮膚的應用，這使其成為再生醫學治療的一個潛在的強有力細胞來源。人類多能干細胞可以在體外培養并分化為人體的所有細胞類型，這些應用需要大量的高質量的細胞。因此，一個用于生產人類多能干細胞及其后代的良好三維系統顯得尤為重要，三維生物系統可以提高人類胚胎干細胞衍生的多能干細胞和成人成體干細胞植入體內后的生存率和再生能力[17]，這一點已被眾多研究人員的實驗結果所證實。Lee等[18]通過實驗證實了干細胞的三維培養較傳統二維培養具有更高的生存率和基因組穩定性；Barsby等[19]通過實驗證明在同一時間內三維培養模型誘導干細胞分化水平遠超出二維培養，三維細胞培養大大促進胚胎干細胞分化；Lin等[20]也通過實驗證明了三維條件下培養的干細胞具有更好的分化潛能。

三維細胞模型使干細胞分化在疾病建模和再生醫學中的潛力得以發揮[21]。例如與傳統單層培養相比，三維培養能顯著改善肝細胞的分化和功能，結合干細胞三維聚集，干細胞可成為肝臟疾病細胞治療一個新的來源[22]。另外，在組織工程領域，臨床上肌肉骨骼組織的需求特別高，尤其是軟骨和骨缺損[23]，三維技術也已被應用于骨及軟骨的損傷再生；三維細胞模型還為神經元生長提供了良好的支架[24]，神經元在其中可以自由地向各個方向生長，形成神經元網絡，這為神經細胞再生的研究提供了更好的方法[25]，并為神經退行性疾病的治療提供了前景。

4 展望

目前眾多研究對細胞三維培養與傳統細胞培養模式的優缺點進行了比較分析。細胞三維培養因更加真實地模擬體內組織結構及微環境，廣泛應用于醫學各個研究領域，取得了一定的成就。但細胞三維培養技術有著諸多優點的同時，仍然需要面臨不斷發展和應對許多挑戰，例如高質量成像技術的發展，三維培養中復雜形態功能的評估，三維培養設備的發展以及培養方法的完善等。綜上所述，三維培養作為最主要的細胞培養技術，發展空間和挑戰并存。有待進一步完善。

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