氯霉素分子印跡聚合物的制備及性能研究

陳潔忠，周會艷，張琳

（濟源職業(yè)技術學院濟源市基礎藥理研究重點實驗室，河南濟源459000）

氯霉素（chloramphenicol，CAP）屬于酰胺醇類抗生素，是一種廣譜高效抗菌藥，可有效抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌，具有顯著的抗菌作用和藥物代謝動力學特性，價格低廉，廣泛應用于各種傳染性疾病的治療[1]。由于其對人體的免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)具有嚴重的毒副作用[2]，目前禁止氯霉素用于動物性食品和水產(chǎn)品中，國際上已明確規(guī)定氯霉素在牛奶和動源性食品中零殘留限量的標準[3]。

對氯霉素的殘留檢測方法主要包括微生物法、免疫分析法、色譜法、超臨界流體色譜法和毛細管電泳法等，但這些方法自身都有不可避免的缺點[4-7]。如高效液相色譜法最低檢測限較高，需經(jīng)過復雜的樣品預處理過程；酶聯(lián)免疫法的測定結(jié)果有較高的假陽率且不能用于現(xiàn)場檢測。分子印跡技術是一種基于抗原-抗體理論，在生物化學、高分子化學、材料科學等多門學科的基礎上形成的新型技術[8-9]。利用分子印跡技術制備的分子印跡聚合物對特定模板分子具有較高的特異性識別能力，能將干擾物雜質(zhì)較為徹底的去除，能夠準確識別待測目標化合物[10-12]。然而傳統(tǒng)分子印跡聚合物的制備方法存在傳質(zhì)較慢、結(jié)合效率低和模板分子泄露等問題[13-14]。由于表面分子印跡技術（surface molecular imprinted technique，SMIT）是將模板分子與功能單體在溶劑中反應所形成的復合物接枝到表面經(jīng)過活化修飾的硅膠、玻璃等介質(zhì)表面上，然后再加入引發(fā)劑進行印跡聚合反應而制得，該方法是在聚合物的表面建立印跡位點，可以有效克服傳統(tǒng)聚合方法中的問題[15-18]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)以表面聚合法制備的聚合物具有特異的選擇性、更易接近的結(jié)合位點、快速的傳質(zhì)速率和較高的結(jié)合動力學等優(yōu)點[19-20]。因此，采用SMIT制備氯霉素分子印跡聚合物，并研究其吸附性能，對檢測生物樣品中殘留的微量氯霉素，進一步保障食品安全，維護環(huán)境生態(tài)，促進人體健康具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯霉素（chloramphenicol，CAP）：西安仁達生物醫(yī)藥有限公司；乙二酸二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EDMA）：美國 Sigma公司；球形硅膠：日本東京株式會社；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）：北京百靈威公司，純度98%；（分析純）甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）：天津市化學試劑研究所；（化學純）偶氮二異丁腈（2，2’-azodiisobutyronitrile，AIBN）：上海試劑四廠；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸（分析純）：西安化學試劑廠；甲苯（分析純）：天津市雙船化學試劑廠；甲醇、乙腈（色譜純）：天津科密歐化學試劑有限公司；鹽酸、三乙胺、丙酮、冰醋酸（分析純）：天津耀華化學試劑有限公司。

SHIMADZU色譜系統(tǒng)（包括：LC-20A泵、SPD-20A紫外檢測器、CS-Light實時分析色譜工作站）、AUY220型電子天平：日本島津公司；METTLERTOLEDO FE20/EL20 PH計：德國梅特勒-托利多集團；XK96-A快速混勻器：姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司；JSM-6390A型掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 硅膠的活化及改性

稱取球型硅膠12 g分散于100 mL 10%HCl溶液中，110℃加熱攪拌回流24 h后用大量蒸餾水洗至中性，60℃干燥24 h后得到活化硅膠，備用。稱取活化硅膠5 g于100 mL圓底燒瓶中，依次加入50 mL甲苯、2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和1 mL三乙胺，110℃加熱攪拌回流24 h。反應后用甲醇多次減壓抽濾以除去未反應的試劑，60℃干燥24 h即得改性硅膠。

1.2.2 氯霉素分子印跡聚合物的制備

稱取CAP 0.1719 g（0.5 mmol）于50 mL錐形瓶中，加10 mL甲醇超聲溶解后加入10 mL乙腈，168 μL功能單體MAA（1∶4，摩爾比），2 g改性硅膠，室溫下攪拌過夜以進行預組裝。然后加入952 μL交聯(lián)劑EDMA（交聯(lián)度85%）和0.016 4 g引發(fā)劑AIBN，超聲攪拌20 min后向溶液中通入氮氣20 min，將錐形瓶密封，60℃水浴攪拌反應24 h。反應結(jié)束后將反應產(chǎn)物減壓抽濾，并用大量甲醇洗滌，以除去未反應的試劑，用丙酮漂洗，以除去細小的聚合物碎片。以甲醇-冰醋酸（4∶1，體積比）為提取液索氏提取24 h以除去模板分子。依次用乙腈-水（20∶80，體積比）、甲醇洗至中性，60℃真空干燥24 h后得到氯霉素表面分子印跡聚合物（surface molecularly imprinted polymers，SMIPs）。空白印跡聚合物（surface non-imprinted polymers，SNIPs），除不加入模板分子外，均按照上述方法平行操作。

1.2.3 改性硅膠和SMIPs的形態(tài)表征

分別取一定量的改性硅膠和SMIPs，烘箱60℃干燥24 h，樣品噴金后，通過掃描電子顯微鏡對其進行形態(tài)表征。

1.2.4 等溫吸附性能研究

精密稱取SMIPs和SNIPs各20.0 mg于10 mL錐形瓶中，分別依次加入10 mL濃度為900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、20 μg/mL 的 CAP 水溶液，室溫下振蕩吸附2 h，吸取上清液經(jīng)微孔濾膜濾過后采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定。色譜條件：流動相：甲醇-（0.065 mol/L，pH5.8）磷酸鹽緩沖溶液（70∶30，體積比）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：277 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

1.2.5 吸附動力學研究

精密稱取SMIPs和SNIPs各20.0 mg于10 mL錐形瓶中，分別加入10 mL濃度為700 μg/mL的CAP水溶液，室溫下進行振蕩吸附 0.5、1、2、5、10、15、20 min，吸取上清液經(jīng)微孔濾膜濾過后采用HPLC法測定。色譜條件：流動相 ∶甲醇-（0.065 mol/L，pH5.8）磷酸鹽緩沖溶液（70∶30，體積比）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：277 nm；進樣量：20 μL；柱溫：25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性硅膠和SMIPs的形態(tài)表征

改性硅膠和SMIPs的掃描電鏡圖見圖1。

圖1 改性硅膠和SMIPs的電鏡掃描圖Fig.1 SEM of modified silica particles and SMIPs

從圖1中可看出改性硅膠表面較光滑平整，而SMIPs表面較粗糙，覆蓋有聚合物層，形貌的變化說明印跡聚合物已接枝到硅膠表面，試驗成功制備了以硅膠為基質(zhì)的分子印跡聚合物。

2.2 SMIPs和SNIPs等溫吸附性能研究

氯霉素分子印跡聚合物等溫吸附曲線見圖2。

圖2 氯霉素分子印跡聚合物等溫吸附曲線Fig.2 CAP SMIPs isothermal adsorption curve

從圖2中可以看出，SMIPs與SNIPs對模板分子CAP的吸附量均隨著CAP濃度的升高而增大，但是SMIPs對CAP的吸附量顯著大于SNIPs，原因是在聚合過程中由于模板分子的存在，使聚合物內(nèi)部形成了與模板分子能夠進行特異性結(jié)合的三維孔穴結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對模板分子的結(jié)構(gòu)類似物也有一定的特異性吸附能力，在吸附起始階段聚合物的結(jié)合位點處于空置的狀態(tài)，因此吸附向正方向進行，表現(xiàn)為隨著CAP濃度的增加，SMIPs與SNIPs對CAP的吸附量呈現(xiàn)出增長的趨勢。當CAP的濃度增大到一定值時，SMIPs與SNIPs對CAP的吸附量達到飽和，SMIPs的飽和吸附量為 51 μg/mg，SNIPs的飽和吸附量為 17 μg/mg。這是因為在吸附過程中，聚合物的結(jié)合位點逐漸飽和，從而聚合物的吸附達到了平衡，曲線上表現(xiàn)為較平坦。

根據(jù)結(jié)合前后溶液中CAP的濃度變化計算SMIPs（或 SNIPs）對 CAP的結(jié)合量 Q，以 Q/C對 Q作圖即得到Scatchard圖見圖3。

如圖3所示：SMIPs中Q/C對Q呈明顯的非線形關系，表明SMIPs對模板分子CAP存在不同的結(jié)合位點。圖中兩條直線均呈現(xiàn)出較好的線性關系，表明在本試驗的濃度范圍內(nèi)，SMIPs存在兩種不同的結(jié)合位點，一類為結(jié)合力強的高親和力位點，另一類為結(jié)合力弱的低親和力點。

圖3 Scatchard模型分析圖Fig.3 Scatchard model analysis diagram

2.3 SMIPs和SNIPs吸附動力學研究

通過吸附動力學分析來考察SMIPs對模板分子CAP達到吸附平衡所需的時間，結(jié)果如圖4所示。

圖4 SMIPs和SNIPs對氯霉素的吸附動力學曲線Fig.4 Adsorption kinetic curves of SMIPs and SNIPs on chloramphenicol

從圖4中可看出，SMIPs與SNIPs對模板分子CAP的吸附量均隨著吸附時間的增加而增大，但是SMIPs對CAP的吸附量顯著大于SNIPs，2 min時即可達到吸附平衡。這是由于在吸附的起始階段，位于SMIPs表面的結(jié)合位點首先與CAP進行特異性結(jié)合，當位于表面的結(jié)合位點達到飽和時，位于聚合物內(nèi)部的結(jié)合位點開始進行特異性吸附，此時吸附速率降低，當結(jié)合位點達到飽和后吸附達到平衡。SMIPs只需2 min即可達到吸附平衡，表明合成的印跡聚合物與模板分子之間有快速的傳質(zhì)速率和結(jié)合動力學。

3 結(jié)論

以硅膠為基質(zhì)，利用SMIT制備的SMIPs，吸附動力學研究結(jié)果顯示吸附達到平衡的時間為2 min；等溫吸附研究結(jié)果表明SMIPs對氯霉素的最大吸附量為51 μg/mg，SNIPs對氯霉素的最大吸附量為 17 μg/mg，SMIPs對氯霉素的吸附量明顯高于 SNIPs，經(jīng)Scatchard分析，SMIPs主要存在兩類不同的結(jié)合位點與氯霉素進行作用。由此可見，SMIPs具有較好的機械性能，結(jié)合位點較多位于聚合物的表面，使模板分子易于洗脫，提高了吸附容量和傳質(zhì)速率，克服了傳統(tǒng)方法的缺點，有利于檢測動物源性食品中的氯霉素是否符合標準。

參考文獻：

[1]李秀萍,尉新華,孫艷.淺談氯霉素的危害及控制[J].中國動物免疫,2003,20(5)：18

[2]胡項飛,沈建忠.氯霉素類抗生素的殘留分析[J].中國獸藥雜志,2001,35(5)：55-57

[3]GEORAGE W C.Food safety first[J].Advocate,2002,5(1)：2-4

[4]王榮艷,王培龍,佘永新,等.分子印跡基質(zhì)固相分散-液相色譜法測定牛奶中的氯霉素殘留[J].分析試驗室,2009,28(8)：26-28[5]胥傳來,彭池方,郝凱.化學發(fā)光酶免疫法測定水產(chǎn)品中殘留氯霉素[J].分析化學,2005,33(12)：1809

[6]高林,陸怡,史賢明.水產(chǎn)品中氯霉素殘留檢測技術的研究進展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2009(20)：340-341

[7]RAMOS M,MUNOZ P,ARANDA A,et al.Determination of chloramphenicol residues in shrimps by liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2003,791(1)：31-38

[8]Haupt K.Molecularly imprinted polymers：The next generation[J].Anal Chem,2003,75(17)：376-383

[9]姜忠義.分子印跡技術在藥物分離和分析中的應用[J].藥物分析雜志,2002,22(5)：414-417

[10]Caro E,Marce R,Borrull F,et al.Application of molecularly imprinted polymers to solid-phase extraction of compounds from environmental and biological samples[J].Trends Anal Chem,2006,25(2)：143-154

[11]Li Y Q,Li X,Li Y,et al.Selective recognition of veterinary drugs residues by artificial antibodies designed using a computational approach[J].Biomaterials,2009,30(18)：3205-3211

[12]Sun XL,He XW,Zhang YK,et al.Determination of tetracyclines in food samples by molecularly imprinted monolithic column coupling with high performance liquid chromatography[J].Talanta,2009,79(3)：926-934

[13]Huang CY,Syu MJ,Chang YS,et al.A portable potentiostat for the bilirubin-specific sensor prepared from molecular imprinting[J].Biosens Bioelectron,2007,22(8)：1694-1699

[14]Urraca JL,Moreno-Bondi MC,Orellana G,et al.Molecularly imprinted polymers as antibody mimics in automated on-line fluorescent competitive assays[J].Anal Chem,2007,79(13)：4915-4923

[15]Patten TE,Matyjaszewski K.Atom transfer radical polymerization and the synthesis of polymeric materials[J].Adv Mater,1998,10(12)：901-915

[16]Nicholas WT,Christopher WJ,Keith RB,et al.From 3D to 2D：A review of the molecular imprinting of proteins[J].Biotechnol Prog,2006,22(6)：1474-1489

[17]尹曉斐,湯水粉,劉瑋.表面分子印跡技術研究進展[J].福州大學學報(自然科學版),2011,39(5)：639-648

[18]張衛(wèi)英,李曉,朱蘭蘭.表面分子印跡材料制備研究進展[J].現(xiàn)代化工,2005,25(12)：20-23

[19]Guijarro-Diez M,Paniagua G,Fernandez P,et al.Molecularly imprinted SPE and MEKC with in-capillary sample preconcentration for the determination of digoxin in human urine[J].Electrophoresis,2012,33(11)：1582-1588

[20]Tang K,Gu X,Luo Q,et al.Preparation of molecularly imprinted polymer for use as SPE adsorbent for the simultaneous determination of five sulphonylurea herbicides by HPLC[J].Food Chem,2014(150)：106-112