籽瓜濃縮汁的降血糖及降血脂活性研究

馬樂萍，田麗萍，*，張義暉，王金輝，薛琳

（1.石河子大學藥學院，新疆石河子832000；2.石河子蔬菜研究所，新疆石河子832000）

籽瓜 Citrullus lanatus.convar megulaspemus（L.），又名打瓜，是西北地區主要經濟作物，其中新疆為主產區，其面積、產量占全國的90%。《本草綱目》及《飲膳正要》中記載“籽瓜汁，主消渴，治心煩，解尿毒”，飲用籽瓜汁可平糖，穩糖，解糖毒。經常食用籽瓜可止咳喘，利尿頻，平干燥，潤心肺，排毒氣，防衰老和增體魄的作用。籽瓜在瓜類栽培中占有一定的地位，但缺乏活性方面應有的研究，目前所見籽瓜資料一般套用普通西瓜資料，故對籽瓜進行活性方面的研究勢在必行[1]。本課題組前期安全性評價試驗中證明籽瓜濃縮汁的安全性很高，具有很好的開發利用價值。系統藥理學為人們從整體水平來研究中藥復方提供了可行的理論與思路。其可用于藥物作用機制的研究與新藥開發。通過該理論方法對單味藥開展研究，篩選活性成分并預測其網絡靶點，從系統水平闡明其作用機制；預測該藥物對其他疾病的潛在治療作用。利用該理論方法從分子和系統水平上來揭示單味藥在治療某個疾病中的作用機制。本文通過對籽瓜濃縮汁的降血糖和降血脂方面的活性進行研究，系統的闡釋籽瓜在降血糖和降血脂方面的活性，并為新型降血糖降血脂保健品研究提供一定的理論依據。

1 材料

1.1 儀器

SK-5200型超聲波清洗器：上海科導超聲儀器有限公司；HHS-1-Ni電熱水浴鍋：北京市永光明醫療儀器廠；RE-2000型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵：鞏義市英峪子華儀器廠；BP211D型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；3001型酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 藥物與試劑

籽瓜濃縮汁（去皮去籽→壓榨取汁→酶處理→滅酶→離心分離→過濾→濃縮→殺菌即得）：石河子博華駝鈴生物科技有限公司；試驗用水為蒸餾水；格列本脲片（批號：120203）：天津太平洋制藥有限公司；四氧嘧啶（批號：140312）：上海藍季科技發展有限公司；鏈脲佐菌素（批號：140217）：上海如吉生物科技有限公司；辛伐他丁片（批號：1311317）：山東鳳凰制藥有限公司；10%fat實驗動物飼料（批號：20140425）、45%fat實驗動物飼料（批號：20140425）：江蘇美迪森生物醫藥有限公司。

1.3 實驗動物

清潔級昆明種小鼠：石河子大學實驗動物中心，雄性，體重 18 g～22 g，生產許可證號 SCXK（新）2013-0033，飼養于石河子大學藥學院動物房。

2 方法

2.1 籽瓜濃縮汁中化合物的系統藥理學研究

通過西北農林科技大學王永華教授實驗室平臺，利用系統藥物打靶軟件SysDT及藥物組合軟件PreDC對籽瓜濃縮汁活性成分進行篩選。通過構建化合物-靶點-疾病（compound-target-disease，C-T-D）網絡系統，整體地揭示分子-靶點蛋白與靶點蛋白-疾病表型的關聯，并從網絡層面研究籽瓜濃縮汁的降血糖作用。對李倩楠等[2]分離鑒定的8個化合物進行靶點預測，并繪制分子-靶點和靶點-疾病的藥理學網絡圖。

2.2 樣品的制備

量取1 L籽瓜濃縮汁，旋蒸濃縮至近干，干燥后即得籽瓜濃縮汁樣品。

2.3 對四氧嘧啶（alloxan，ALX）致糖尿病小鼠的影響[3]

取正常小鼠60只，其中50只腹腔注射四氧嘧啶（72 mg/kg），72 h后檢測血清葡萄糖水平。小鼠隨機分為對照組，模型組，格列本脲（2.5 mg/kg）組，籽瓜濃縮物高中低劑量組（200、150、100 mg/kg），每組小鼠10只。每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續4周。于每周日給藥后0.5 h從小鼠眼眶采血測其血清葡萄糖（glucose，GLU）值，并于末次測定完小鼠血糖后給予質量濃度200 g/L的葡萄糖溶液灌胃（0.01 mL/g），測定 0、0.5、2 h 的血糖值，計算血糖曲線下面積。

2.4 對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）致糖尿病小鼠的影響[4]

取正常小鼠70只，其中60只腹腔注射鏈脲佐菌素（150 mg/kg），72 h后檢測血清葡萄糖水平。小鼠隨機分為對照組，模型組，格列本脲（2.5 mg/kg）組，籽瓜濃縮物高中低劑量組（200、150、100 mg/kg），每組小鼠10只。每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續4周。于每周日給藥后0.5 h從小鼠眼眶采血測其血清GLU值，并于末次測定完小鼠血糖后給予質量濃度200 g/L的葡萄糖溶液灌胃（0.01 mL/g），測定0、0.5、2 h的血糖值，計算血糖曲線下面積。

2.5 對正常小鼠血糖的影響[5-6]

取正常小鼠40只，隨機分為對照組，格列本脲（2.5 mg/kg）組和籽瓜濃縮物高中低劑量組（200、150、100 mg/kg），每組小鼠各10只。對照組給予等體積生理鹽水，藥物或蒸餾水每日灌胃給藥1次，連續4周。于每周日給藥后0.5 h從小鼠眼眶采血測其血清GLU值，并于末次測定完小鼠血糖后給予質量濃度200 g/L的葡萄糖溶液灌胃（0.01 g/mL），測定 0、0.5、2 h 的血糖值，計算血糖曲線下面積。

2.6 糖耐量的測定[5-9]

血糖曲線下面積=0.5×（0 h血糖值+0.5 h血糖值）×0.5+0.5×（2 h血糖值+0.5 h血糖值）×1.5+0.25×（0 h血糖值+4×0.5 h血糖值+3×2 h血糖值）。

2.7 對高脂飼料致高血脂小鼠的影響[7]

取正常小鼠60只，其中10只飼喂普通飼料，其余50只飼喂高脂飼料，飼喂4周。高血脂小鼠隨機分為模型組，辛伐他汀（7 mg/kg）組，籽瓜濃縮物高中低劑量組（200、150、100 mg/kg），每組小鼠 10只。每天灌胃給藥1次，對照組和模型組給予等體積生理鹽水，連續4周。于每周日給藥后禁食12 h，后眼眶采血，3 000 r/min離心10 min，取上層血清并測定其血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）。最后一次采血過后對各組取完血的小鼠進行解剖，摘取小鼠的肝臟左葉，制作石蠟包埋切片并進行HE染色，觀察肝臟組織病理學變化情況。

2.8 統計學處理

采用SPSS17.0軟件進行統計學處理，數據以區±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 分子-靶點網絡

利用候選分子與它們的靶點構建分子-靶點網絡，挖掘出分子-靶點之間的聯系，從而篩選出有效核心分子和靶點。在籽瓜的這個分子-靶點網絡中，由2個候選藥物分子化合物02（MOL02）（2，6-二甲氧基-4-羥基-苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）和化合物04（MOL04）（松柏苷）和3個候選靶點組成5個節點和6條邊，2個分子均與13個靶點連接（度=13）。籽瓜中度≥1的化合物對應的靶點結果見表1，根據表1所示，籽瓜濃縮汁的2個活性成分均可以與所有靶點鏈接，這表明這兩個分子之間存在潛在的協同效應。籽瓜濃縮汁的化合物-靶點網絡圖見圖1，其中長方形為化合物，圓形為靶點。

籽瓜濃縮汁的化合物-靶點網絡見圖1，籽瓜中度≥1的化合物對應的靶點見表1。

圖1 籽瓜濃縮汁的化合物-靶點網絡Fig.1 The compound-target network of watermelon juice concentrate

表1 籽瓜中度≥1的化合物對應的靶點Table 1 The target of more than 1 moderate melon corresponding compounds

在籽瓜的這個分子-靶點網絡中（圖1），籽瓜濃縮汁中的2個活性成分與13個靶點連接。其中DPP-4（dipeptidyl peptidase 4）二肽基肽酶4，通過分解糖降血糖素如葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）在糖代謝中起著重要的作用。由于DPP-4在血液和肝臟中大量存在，并對GLP-1和GIP的水解非常迅速[8]。而GLP-1和GIP與2型糖尿病有著密切的關系，在血糖濃度控制方面發揮重要作用。由于DPP-4可以快速地使GLP-1失活，所以DPP-4是治療2型糖尿病的關鍵靶點之一。MGEA5是O-連接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-Glc NAc），O-Glc NAc修飾在細胞的代謝過程中起著很重要的作用，設計和合成其水解酶（O-Glc NAcase）的抑制劑有利于研究許多細胞活動中的O-Glc NAc修飾現象，從而揭示與這種修飾相關的重大疾病（Ⅱ型糖尿病，阿爾茨海默病，癌癥和心血管疾病）的病因，O-Glc NAc調節紊亂將導致糖尿病、神經退化性疾病、癌癥等多種重大疾病的發生[9]。SLC5A2（sodium-glucose co-transporter 2）鈉葡糖糖共轉運蛋白2，特異性的分布在腎臟近曲小管S1部位，負責約90%葡萄糖的重吸收；研究認為，可以通過抑制SLC5A2的活性來特異性阻斷腎臟對葡萄糖的重吸收，通過尿排出多余的葡萄糖而達到降低血糖的作用，同時沒有體重增加和低血糖的風險[10]。因此SLC5A2在調節葡萄糖的動態平衡中具有重要的作用。

3.2 靶點-疾病網絡

通過建立靶點-疾病網絡，連接蛋白靶點和疾病，研究靶點與疾病之間的相互關系，理解籽瓜濃縮汁的作用機制。籽瓜濃縮汁的靶點-疾病網絡圖見圖2。5個靶點，連接到8種疾病。其中圓形為靶點，長方形為疾病，三角形為疾病對應的醫學主題詞。籽瓜候選靶點的網絡參數和相關疾病結果見表2。

靶點分析顯示，籽瓜的5個靶點連接到8種疾病。其中度最高的靶點是SLC5A2（度=4），其次是DPP4（度=3）等，涉及的疾病有胰腺癌，高血糖，高胰島素血癥，肥胖，糖尿病及糖尿病并發癥。尤其是在Nutritional&Metabolic Diseases（營養和代謝疾病）（C18）（度=5）及 Endocrine Diseases（內分泌疾病）（C19）（度=3）上涉及到的疾病較多。在《本草綱目》中記載“籽瓜性味甘”，《本草求真》記載“籽瓜肉入心脾胃，止消渴”，該方面在臨床上的應用為高血糖及高血脂的預防與改善，這與我們通過靶點預測的結果是一致的。

圖2 籽瓜濃縮汁的靶點-疾病網絡Fig.2 The target-disease network diagram of watermelon juice concentrate

表2 籽瓜候選靶點的網絡參數和相關疾病Table 2 The network parameters of watermelon candidate targets and related diseases

3.3 對各組小鼠體重的影響

與模型組相比，籽瓜濃縮汁并沒有改變小鼠體重的變化趨勢，與模型組小鼠體重差異并不明顯，結果見圖3、圖4、圖5。

圖3 對ALX致高血糖小鼠體重的影響（n=10）Fig.3 Effect of ALX on body-weight of hyperglycemic mice（n=10）

圖4 對STZ致高血糖小鼠體重的影響（n=10）Fig.4 Effect of STZ on body-weight of hyperglycemic mice（n=10）

3.4 對高血糖小鼠血糖的影響

給藥4周后，ALX及STZ致高血糖小鼠的各給藥組的血糖值與各自模型組相比明顯降低，有顯著性的差異（P＜0.05），具有顯著的降血糖功效。在ALX致高血糖小鼠模型中，籽瓜濃縮汁高、中、低劑量組可不同程度地降低血糖小鼠的血糖值，其中中、低劑量組的降血糖效果優于高劑量組。正常血糖小鼠各藥組的血糖值與各自模型組相比無顯著變化，都處于正常血糖值范圍內，證明籽瓜濃縮汁久食亦不會引起低血糖。結果見圖 6、圖 7、圖 8。

圖5 對正常小鼠體重的影響（n=10）Fig.5 Effect on body-weight of normal mice（n=10）

圖6 對ALX致高血糖小鼠血糖的影響（n=10）Fig.6 Effect of ALX on blood glucose in mice with hyperglycemia（n=10）

圖7 對STZ致高血糖小鼠血糖的影響（n=10）Fig.7 Effect of STZ on blood glucose in mice with hyperglycemia（n=10）

圖8 對正常小鼠血糖的影響（n=10）Fig.8 Effect of glucose on normal mice（n=10）

3.5 對小鼠糖耐量的影響

與模型組相較，籽瓜濃縮汁各劑量組可顯著降低兩種高血糖小鼠的糖耐量，有極顯著性的差異（P＜0.01）。其中中劑量組小鼠血糖已經接近正常小鼠的糖耐量，結果見表3。

3.6 對高血脂小鼠的影響

與模型組相比，籽瓜濃縮汁并沒有改變小鼠體重的變化趨勢，與模型組相比小鼠體重并無顯著性差異。給予陽性藥和籽瓜濃縮汁4周后，各劑量組小鼠的TC、TG含量與模型組相比均有顯著性降低（P＜0.05）；其中中，低劑量組小鼠的值已與正常組相當。實驗表明籽瓜濃縮汁對小鼠血清血脂的清除具有一定的效果。結果見圖9、圖10、圖11。

表3 對高血糖小鼠糖耐量的影響（n=10）（±s）Table 3 Effect of high glucose on glucose tolerance in mice（n=10）（±s）

表3 對高血糖小鼠糖耐量的影響（n=10）（±s）Table 3 Effect of high glucose on glucose tolerance in mice（n=10）（±s）

注：##與正常組比較差異極顯著，P＜0.01；**與模型組比較差異極顯著，P＜0.01。

組別 模型組 陽性組 高劑量組 中劑量組 低劑量組四氧嘧啶 49.20±2.01##35.48±1.93**鏈脲佐菌 47.70±1.82##40.95±1.85**42.48±2.22**27.68±2.18**36.85±2.04**正常血糖 25.28±2.12 22.68±2.03 26.70±2.15 26.10±2.01 26.28±2.01 37.33±2.07**32.50±2.01**28.13±1.91**

圖9 對高血脂小鼠體重的影響（n=10）Fig.9 Effect of polysaccharides on weight variation of diabetic mice

圖 10 對高血脂小鼠TC的影響（n=10）Fig.10 Effect of TC on hyperlipidemia mice

圖11 對高血脂小鼠TG的影響（n=10）Fig.11 Effect of TG on hyperlipidemia mice（n=10）

3.7 對高血脂小鼠肝臟的影響

正常小鼠肝臟肝血竇豐富，較密集，細胞質中沒有脂肪堆積現象。模型組小鼠肝臟表面呈灰黃色，肝細胞具有顯著脂肪變性，大量脂肪液滴在細胞質中堆積。各給藥組小鼠肝臟脂肪液滴堆積減少，以籽瓜濃縮汁中劑量組最為明顯，說明中劑量的籽瓜濃縮汁具有較好的抑制脂肪堆積的作用。見圖12。

圖12 對高血脂小鼠肝臟的影響（40x）Fig.12 Effects on the liver of hyperlipidemic mice（40x）

4 討論

由于人們飲食結構不合理與環境因素的影響，糖尿病發病率現已逐年升高，且發病人群逐漸趨向平民化，年輕化。高脂血癥也是由于人們飲食結構不合理以及環境因素的影響引起的疾病，主要與現代人飲食結構中富含大量油脂有關，臨床上常與糖尿病伴隨發作。目前臨床上常用的降血糖和降血脂藥物長期服用都會產生較多的不良反應。因此，從天然食品中開發有效而又長效的降血糖和降血脂藥物具有重要的臨床意義。

四氧嘧啶和鏈脲佐菌素都是是胰島β細胞毒劑，通過損傷細胞使β細胞合成的前胰島素減少，進而導致胰島素缺乏，從而導致小鼠產生糖尿病。因其對生物其他組織毒性小，動物存活率高，是目前國內外使用較多的糖尿病動物造模試劑。本實驗發現，籽瓜濃縮汁具有顯著的降血糖作用，可顯著降低四氧嘧啶與鏈脲佐菌素所致的2種高血糖模型的血糖值，在鏈脲佐菌素致高血糖模型中尤其明顯。與模型組相比，籽瓜高、中、低劑量組可不同程度地降低糖尿病小鼠血糖值。在正常小鼠模型中，籽瓜濃縮汁對正常小鼠血糖無明顯影響，證明籽瓜濃縮汁不會產生低血糖癥狀，這在降血糖藥物中尤為重要，避免了會產生低血糖癥狀這一降血糖藥物最重要的不良反應[11]。通過對籽瓜濃縮汁中2個候選藥物分子MOL02（2，6-二甲氧基-4-羥基-苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）和MOL04（松柏苷）的預測，籽瓜濃縮汁可能是通過調節靶點DPP-4，MGEA5和SLC5A2，從而達到降血糖及降血脂作用。

糖耐量異常也屬于代謝綜合癥范疇，當胰島素的生理作用降低，無法維持正常血糖水平時，隨之就會出現糖耐量減退，引起空腹血糖增高，隨著病情的發展，血糖將進一步增高從而引起糖尿病并發癥。因此，改善糖耐量也已經成為糖尿病的一項重要檢測指標。本次研究發現，籽瓜濃縮汁可明顯改善高血糖模型小鼠的糖耐量。

同時，與模型組和陽性組相比，籽瓜濃縮汁高、中、低劑量組具有顯著的降血脂作用，可明顯降低高血脂模型小鼠的TG、TC。同時相較于陽性藥，對小鼠肝臟也具有很好的保護作用，能夠較好的抑制脂肪堆積。同時在肝臟切片中，我們還發現籽瓜濃縮汁也對發生炎癥的肝臟細胞也具有很好的恢復作用。

綜上所述，籽瓜濃縮汁可有效降低糖尿病小鼠血糖，增加糖尿病小鼠糖耐量，并降低高血脂小鼠血脂水平，同時對肝臟細胞還具有一定的保護作用，此結果符合對籽瓜濃縮汁的系統藥理學分析。本研究為新型降血糖降血脂保健品研究提供一定的理論依據。

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