金銀花葉黃酮體外抗氧化能力及對H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞損傷的保護作用

羅 磊，張冰潔，馬麗蘋，樊金玲，朱文學，關寧寧，薛依涵

（河南科技大學食品與生物工程學院，河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023）

細胞在新陳代謝過程中會產生自由基，這些自由基影響著體內調控系統，自由基過多便會氧化細胞膜、酶、DNA及蛋白質等物質，對機體造成損傷[1]。此外，研究表明，自由基與癌癥、衰老、炎癥，心腦血管等多種疾病的發生與發展密切相關[2]。因此，具有清除自由基作用的食品及藥品的研究日趨受到人們的重視。近年來，中藥被認為是“天然自由基清除劑”，并對其開展了各種清除自由基的實驗研究[3]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為藥食同源性植物，具有清熱解毒、抗炎、抗病原微生物、免疫調節等功效[4-5]，其葉具有產量大，生物活性成分豐富，抗氧化、抑菌功效較好等優點，但長期被作為金銀花的副產物而被丟棄，造成了資源浪費[6-8]。有研究顯示，金銀花葉中黃酮含量是花中的2.78 倍，且金銀花葉的抑菌能力與花相同甚至高于花[9]。翟鳳艷等[10]研究顯示，金銀花葉提取物對植物真菌的抑菌效果較強。文獻[11-13]報道金銀花葉粗黃酮具有良好的抗氧化活性。但以上研究都是采用單一的方法對金銀花葉粗提物進行功效方面的評價，而對金銀花葉黃酮純化物的功效作用研究較少。此外，由于不同評價方式及其適用范圍的不同使實驗結果也存在差異。

為系統準確地評價金銀花葉黃酮的抗氧化活性，深入了解其功效機理，本實驗以VC為對照，既采用了較為廣泛的體外抗氧化評價方法，又建立了H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞損傷模型，以評價金銀花葉黃酮的體外及細胞抗氧化抗炎能力，探索其作用機理，為金銀花葉功能性食品開發及抗氧化抗炎藥物的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花葉黃酮由本實驗室以金銀花葉為原料，采用超聲輔助乙醇提取，經NKA-Ⅱ大孔吸附樹脂純化所得。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640培養基 美國Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素） 美國Gibco公司；噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）美國Sigma公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

680全自動酶標儀 美國Bio-Rad公司；CKX41倒置顯微鏡 日本Olympus公司；E191IR型CO2細胞培養箱 美國金西盟公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；UV2400紫外-可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HL-2D型恒流泵 上海圣科儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花葉黃酮的制備

1.3.1.1 金銀花葉黃酮的提取

準確稱取金銀花葉粉末100 g，石油醚脫脂處理1 h，用體積分數60%的乙醇按料液比1∶65（m/V）的比例混合均勻，于超聲功率250 W，提取溫度46 ℃的條件下超聲提取30 min，抽濾，45 ℃下減壓濃縮至無醇味，真空冷凍干燥成粉，備用。

1.3.1.2 金銀花葉黃酮的純化

預處理NKA-Ⅱ樹脂，將1.3.1.1節中所得金銀花葉黃酮配制成2.17 mg/mL的上樣液，調節其pH 2.82左右，以1.96 BV/h左右的流速上NKA-Ⅱ樹脂柱進行純化，先用2.0 BV蒸餾水以2.0 BV/h左右的流速洗脫以除雜，再用體積分數75.36%的乙醇溶液以1.47 BV/h左右的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋蒸，凍干后置于4 ℃保存，備用。本實驗中，金銀花葉黃酮經純化后純度為（79.820±0.474）%。

1.3.2 金銀花葉黃酮總還原能力的測定

采用鐵氰化鉀法[14]進行總還原力的測定。量取0.4 mL不同質量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）的樣品溶液，加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL質量分數1%的K3Fe(CN)6溶液，混勻后在50℃水浴中暗處反應20 min，快速置于冰水中冷卻。再加入2.5 mL質量分數10%的三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和質量分數1%的FeCl3溶液0.5 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm波長處測定其吸光度，吸光度越大表明還原力越大。用蒸餾水代替樣品作為空白，VC作為陽性對照，平行做3 次。

1.3.3 金銀花葉黃酮對·OH的清除作用

參考Lai Furao等[15]的方法，并稍作修改。配制不同質量濃度（0.015 6～4.000 0 mg/mL）的金銀花葉黃酮樣品液，分別吸取2 mL上述樣品液，依次添加6 mmol/L的FeSO4溶液0.6 mL、6 mmol/L的H2O2溶液0.6 mL，混勻靜置10 min后加入0.6 mL 6 mmol/L水楊酸，搖勻靜置10 min，于510 nm波長處測定其吸光度A1；同時測定用無水乙醇代替水楊酸時的吸光度A2及用蒸餾水代替樣品液時的吸光度A0，以VC為陽性對照，平行做3 組取平均值。羥自由基（·OH）清除率根據公式（1）計算。

1.3.4 金銀花葉黃酮對·的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化法[16]進行測定，分別取pH 8.2 Tris-HCl緩沖液4.0 mL于25 ℃水浴20 min，加入不同質量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）的金銀花葉黃酮樣品液0.5 mL及25 ℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚（10 mmol/L HCl配制）1.0 mL，混勻后25 ℃水浴4 min，隨即加入0.5 mL HCl（8 mol/L）終止反應，于320 nm波長處測定吸光度A1；同時測定用10 mmol/L HCl溶液代替鄰苯三酚時的吸光度A2及用蒸餾水代替樣品液時的吸光度A0，以VC作陽性對照，平行做3 組取平均值。超氧陰離子自由基（O2-·）清除率根據公式（1）計算。

1.3.5 金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用

參照Goupy等[17]的方法并稍作修改，分別吸取不同質量濃度（0.015 6～8.000 0 mg/mL）金銀花葉黃酮的無水乙醇溶液2.0 mL，加入2.0 mL 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）（2×10-4mol/L）的無水乙醇溶液，搖勻，避光反應40 min后，以無水乙醇調零，于517 nm波長處測定吸光度A1；同時，測定2.0 mL不同質量濃度的樣品溶液與2.0 mL無水乙醇的混合液在517 nm波長處吸光度A2；再測2.0 mL空白樣品（蒸餾水）與2.0 mL DPPH的混合液在517 nm波長處的吸光度A0。以VC作為陽性對照，重復3 組取平均值。清除率計算見式（1）。

1.3.6 RAW264.7細胞培養

將RAW264.7細胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養[18]。每隔2～3 d傳代一次，取對數生長期細胞進行后續實驗。1.3.7 H2O2誘導RAW264.7細胞氧化損傷模型的建立

取對數生長期的RAW264.7細胞接種于96 孔板中，每孔200 mL，細胞濃度為2.0×105個/mL。在37 ℃、5% CO2條件下培養24 h至細胞貼壁，棄上清液，加入用RPMI-1640培養基配制的不同濃度的H2O2溶液，每個濃度設6 個復孔。繼續培養24 h后，棄上清液，用PBS洗滌2 次后，每孔分別加入200 mL的培養基及10 mL 5 mg/mL MTT，放入培養箱4 h后停止培養，棄上清液，每孔加入150 mL DMSO，輕微振蕩10 min使紫色結晶溶解，放入酶標儀于490 nm波長處測定吸光度，根據公式（2）計算細胞存活率。

式中：A0為空白組的平均吸光度；A1為特定濃度樣品液組的平均吸光度。

1.3.8 金銀花葉黃酮劑量的篩選

細胞培養過程同1.3.7節，僅將1.3.7節中所加入的RPMI-1640培養基配制的H2O2溶液換為同種培養基配制的不同質量濃度的金銀花葉黃酮溶液，并通過公式（2）計算細胞存活率。

1.3.9 細胞及細胞培養液中MDA、GSH含量、SOD、LDH活力的測定

將細胞濃度為2.0×105個/mL的RAW264.7細胞接種于6 孔板中，每孔2.0 mL，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h至細胞貼壁，吸棄上清液。空白組和模型組加入2.0 mL培養基；實驗組分別加入2.0 mL不同質量濃度的金銀花葉黃酮培養液；對照組加入2.0 mL 250 mg/mL VC培養液，置于培養箱中培養24 h，吸棄上清液，每孔加入750 mmol/L的H2O2溶液2.0 mL，置于培養箱中孵育4 h后將細胞和細胞培養液分離。細胞培養液于4 ℃、1 500 r/min離心5 min后取上清液待測；細胞用PBS清洗2 次后于4 ℃、1 000 r/min離心10 min留細胞團塊，加入0.5 mL的PBS，冰水浴條件下超聲破碎（300 W，3～5 s/次，間隔30 s，重復3 次），待測。所需測定的MDA、GSH含量及SOD、LDH活力參照相應試劑盒方法。

1.4 數據統計分析

使用DPS 7.5統計軟件對實驗數據進行統計分析，測定結果以表示，采用單因素方差分析并用LSD法進行多重比較，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 金銀花葉黃酮體外抗氧化活力

2.1.1 總還原力

圖1 金銀花葉黃酮的總還原力Fig. 1 Reducing power of flavonoids from honeysuckle leaves

樣品中的黃酮會使反應體系中的Fe3+還原成Fe2+，在700 nm波長處吸光度變化反應出還原能力的高低，吸光度越高說明還原能力越強[19]。由圖1可知，隨樣品質量濃度的增加，VC和金銀花葉黃酮的還原力逐漸加強，并成劑量依賴關系。VC的吸光度在質量濃度為1.0 mg/mL時達到最大值5.21，之后保持不變；金銀花葉黃酮的還原力在0.015 6～4.000 0 mg/mL范圍內顯著小于VC（P＜0.05）。當質量濃度為4.000 0 mg/mL時，VC和金銀花葉黃酮吸光度均達到最大，差異不顯著（P＞0.05）。以上結果表明，金銀花葉黃酮在低質量濃度時還原能力不強，而質量濃度大于4.000 0 mg/mL時，其還原能力較強，等同于VC。

2.1.2 ·OH清除能力

圖2 金銀花葉黃酮對·OH的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on hydroxyl free radicals

如圖2所示，在0.015 6～4.000 0 mg/mL的質量濃度范圍內，VC和金銀花葉黃酮對·OH的清除率與質量濃度存在明顯的量效關系。隨著樣品質量濃度的增大，·OH的清除能力也隨之增大，且金銀花葉黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力相近，差異不顯著（P＞0.05）。VC抗氧化能力的IC50值為0.116 0 mg/mL，金銀花葉黃酮的IC50值為0.203 0 mg/mL，VC的·OH清除能力是金銀花葉黃酮的1.75 倍。結果表明，金銀花葉黃酮對·OH的清除效果與VC相近，說明金銀花葉黃酮清除·OH的能力較強。

2.1.3·清除能力

O2-·雖然是相對較弱的自由基，但它能夠與生物大分子相互作用產生活性更強的自由基如·OH、單線態氧等進一步引起組織氧化損傷和多種疾病[20]。因此，采用鄰苯三酚自氧化法測定金銀花葉黃酮清除O2-·的能力。由圖3可知，在0.015 6～8.000 0 mg/mL的范圍內，VC和金銀花葉黃酮對O2-·的清除能力與樣品質量濃度呈正相關，且金銀花葉黃酮和VC對O2-·的清除能力差異不顯著（P＞0.05）。VC的IC50值為0.336 0 mg/mL，金銀花葉黃酮的IC50值為0.417 0 mg/mL，VC的O2-·清除能力是金銀花葉黃酮的1.24 倍。但當樣品質量濃度達到2.000 0 mg/mL以上時，金銀花葉黃酮和VC對O2-·的清除率均達到100%。以上結果表明，金銀花葉黃酮對O2-·的清除能力較強，并在實驗的濃度范圍內表現出劑量依賴性。

圖3 金銀花葉黃酮對O－2·的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on superoxide anion free radicals

2.1.4 DPPH自由基清除能力

圖4 金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig. 4 Scavenging effect of flavonoids from honeysuckle leaves on DPPH free radicals

由圖4可知，金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除作用存在劑量依賴效應，在0.015 6～8.000 0 mg/mL的質量濃度范圍內，隨著樣品質量濃度的增加，DPPH自由基清除率相應增大。在質量濃度較低時，金銀花葉黃酮和VC對DPPH自由基的清除能力差異不顯著（P＞0.05），隨著質量濃度增加，金銀花葉黃酮的DPPH自由基清除率高于同一質量濃度的VC，DPPH自由基清除率達到100%時對應的金銀花葉黃酮和VC的質量濃度分別為1.000 0、4.000 0 mg/mL。由此表明，金銀花葉黃酮對DPPH自由基的清除能力比VC好。金銀花葉黃酮清除DPPH自由基的機理可能是因為黃酮樣品中具有供氫體，可以提供質子還原具有氧化性的自由基，終止自由基的連鎖反應，起到抑制或清除自由基的作用[21]。

2.2 金銀花葉黃酮對H2O2誘導RAW264.7細胞損傷的保護作用

2.2.1 H2O2濃度篩選結果

圖5 H2O2對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 5 Dose-dependent effect of hydrogen peroxide on the viability of RAW264.7 cells

由圖5可知，不同濃度的H2O2對RAW264.7細胞的生長均有一定抑制作用，且細胞存活率隨H2O2濃度的升高而降低。與空白組相比，不同濃度的H2O2均顯著抑制RAW264.7細胞的存活（P＜0.05），當用750 mmol/L H2O2處理時，RAW264.7細胞的存活率達到53.73%。H2O2濃度太低時對細胞造成的損傷不明顯，而H2O2濃度過高則會造成細胞死亡過量，因此建模時H2O2的濃度選取750 mmol/L。

2.2.2 金銀花葉黃酮質量濃度篩選結果

圖6 不同質量濃度金銀花葉黃酮對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 6 Dose-dependent effect of flavonoids from honeysuckle leaves on the viability of RAW264.7 cells

由圖6可知，與空白組相比，一定質量濃度范圍內的金銀花葉黃酮對RAW264.7細胞有促進增殖的作用，但當金銀花葉黃酮質量濃度大于500 mg/mL時會顯著抑制細胞增殖（P＜0.05），因此，金銀花葉黃酮質量濃度選擇125、250、500 mg/mL，將此質量濃度作為推薦劑量進行后續實驗。

2.2.3 RAW264.7細胞及細胞培養液中MDA含量

MDA含量的高低間接反應了細胞受自由基攻擊的嚴重程度[22]。如圖7所示，與空白組相比，模型損傷組細胞和細胞培養液中的MDA含量均有所上升，且有顯著差異（P＜0.05）。金銀花葉黃酮低中高劑量組顯著抑制了H2O2引起的細胞和細胞培養液中MDA含量的增加，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。空白組與VC對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖7 RAW264.7細胞（A）及細胞培養液（B）中MDA含量Fig. 7 MDA contents in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

MDA是生物體內自由基作用于脂質發生過氧化反應得到的氧化終產物[23]。機體內的自由基極易侵害細胞脂中的不飽和脂肪酸，形成脂質自由基，引起脂質過氧化反應。細胞膜中由磷脂酰基鏈和膽固醇組成的區域在細胞中極性最小，溶解有高濃度的氧，更有利于脂質過氧化反應的進行[24]。因此，細胞膜內的MDA含量顯著高于細胞培養液中的MDA含量（P＜0.05）。

2.2.4 RAW264.7細胞及細胞培養液中GSH含量

圖8 RAW264.7細胞（A）及細胞培養液（B）中GSH含量Fig. 8 GSH contents in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

GSH是一種低分子清除劑，可清除O2-?、H2O2、過氧化脂質，其含量多少是衡量機體抗氧化能力的重要因素

[25]。如圖8所示，與空白組相比，模型損傷組細胞和細胞培養液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），而金銀花葉黃酮低、中、高劑量組顯著抑制了H2O2引起的細胞及細胞培養液中GSH含量的下降（P＜0.05），并呈現劑量依賴性。金銀花葉黃酮高劑量組在細胞中的GSH含量接近

VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）；金銀花葉黃酮中劑量組在細胞培養液中的GSH含量接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。

2.2.5 RAW264.7細胞及細胞培養液中SOD活力

圖9 RAW264.7細胞（A）及細胞培養液（B）中SOD活力Fig. 9 SOD activity in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

SOD通過催化超氧陰離子歧化為H2O2和O2，從而達到清除自由基的目的，其活力對細胞的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用[26-27]。由于SOD主要存在于機體的各個組織細胞內[28]，因此細胞中的SOD活力顯著高于其所對應的細胞液（P＜0.05）。如圖9所示，與空白組相比，模型損傷組細胞和細胞培養液中的SOD活力均顯著下降（P＜0.05），而添加金銀花葉黃酮中、高劑量組能有效升高細胞及細胞培養液中SOD活力使其與正常組SOD活力無顯著差異（P＞0.05）。金銀花葉黃酮各劑量組在細胞中的SOD活力均顯著強于VC對照組（P＜0.05）；金銀花葉黃酮中劑量組在細胞液中的SOD活力接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。2.2.6 RAW264.7細胞及細胞培養液中LDH活力

LDH存在于細胞內，細胞受損時細胞膜通透性增加，會引起LDH外漏，因此LDH活力可以反映細胞膜結構的完整性和受氧化損傷程度[29]。如圖10所示，與空白組相比，模型損傷組細胞中的LDH活力顯著降低（P＜0.05），細胞培養液中的LDH活力顯著升高（P＜0.05），表明H2O2使細胞受損引起了LDH外漏。與模型損傷組相比，金銀花葉黃酮各劑量組顯著升高了細胞中LDH活力，降低了細胞培養液中LDH活力（P＜0.05），并呈劑量依賴性，表明金銀花葉黃酮可以預防或減緩細胞膜受損程度，阻止細胞內LDH外漏。金銀花葉黃酮高劑量組在細胞中的SOD活力接近VC對照組，無顯著差異（P＞0.05）。

圖10 RAW264.7細胞（A）及細胞培養液（B）中LDH活力Fig. 10 LDH activity in RAW264.7 cells (A) and culture supernatant (B)

3 討 論

本研究結果表明，在一定質量濃度范圍內，金銀花葉黃酮抗氧化能力隨質量濃度的增大而增強，并呈劑量依賴性。金銀花葉黃酮的總還原力及對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除能力接近甚至高于VC，金銀花葉黃酮具有較好的體外抗氧化性。

本實驗發現經過H2O2損傷后，RAW264.7細胞與細胞培養液中MDA含量均顯著升高，GSH含量以及SOD活力顯著下降，這表明H2O2對RAW264.7巨噬細胞具有明顯的毒性作用；RAW264.7細胞中LDH活力顯著下降，而細胞培養液中LDH活力顯著上升，這可能是由于H2O2使細胞膜結構受到損傷，細胞膜通透性增加，從而使LDH漏到細胞外[30]。用不同劑量金銀花葉黃酮作用于損傷細胞時，上述指標較模型損傷組均獲得了不同程度的改善。金銀花葉黃酮一方面通過提高細胞和細胞培養液中GSH含量及SOD活力，清除機體中有毒有害物質和自由基，從而保護細胞不受過氧化氫的損傷；另一方面通過減少機體中MDA含量，降低脂質過氧化作用形成脂質過氧化物含量，減緩細胞膜系統受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強了機體抵抗自由基攻擊的能力[31]，保持生物膜的結構完整和膜表面蛋白質的功能，有效減輕了LDH向細胞外擴散的程度。

綜上所述，金銀花葉黃酮對H2O2誘導RAW264.7巨噬細胞損傷的保護作用可能與其調節細胞氧化還原系統，清除氧自由基及有害物質，維持細胞膜系統穩定性有關，但其具體機制還需進一步研究。

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