北極海洋紅球菌B7740（Rhodococcus sp.）產類胡蘿卜素和類異戊二烯醌的抗氧化、抗增殖活性

穆 青，陳亞淑，謝筆鈞，楊季芳，陳吉剛，孫智達,*

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.浙江萬里學院生物與環境學院，浙江 寧波 315100）

類胡蘿卜素具有獨特的多支鏈段和共軛雙鍵，是天然色素中最重要的化合物之一。目前自然界發現的天然類胡蘿卜素已有700多種，在生物圈如植物、動物和微生物中都具有廣泛的分布[1]。由于類胡蘿卜素在光化學反應中起到重要的作用，被認定是光保護色素。同時，類胡蘿卜素也是重要的VA前體，而VA是人體必需的微量營養素且不能被人體自身合成，只能靠從外界攝入獲得[2]。因為類胡蘿卜素特殊的富含電子的長多烯碳鏈結構，其具有淬滅單線態氧、清除自由基的重要生理活性[3]，在抗氧化、抗癌、預防白內障、保護視網膜細胞等方面有較廣闊的應用前景，越來越多的被應用于食品和藥物[4-6]。此外，一些微生物在特定的條件下能夠合成類異戊二烯化合物作為次級代謝產物[7-8]，通過微生物生產復雜的類胡蘿卜素和類異戊二烯醌這種經濟環保的方式，使其代謝產物在醫學和食品化學領域得到進一步研究[9-13]。

細菌中的類異戊二烯醌類主要是甲基萘醌和泛醌[14]。其中，甲基萘醌又稱VK2，其結構是由一個2-甲基-1,4-萘醌母環和母環C3位置連結不同數目的異戊二烯側鏈組成。VK2屬于凝血類維生素，因其在食品中微量存在，所以又有“鉑金維生素”之稱[15]。研究發現，VK2不僅有易于被人體吸收利用、生物活性強、安全性高等優點，而且能夠增加骨密度，預防骨質疏松[16]、血管鈣化[17]、肝癌及肝硬化[18]、老年癡呆等。傳統的VK2一般采用化學法合成，具有產率低、產物活性低、副產物多等許多不足，而活性高的VK2僅能通過微生物發酵法制得[19-21]。因此，細菌產生的類異戊二烯醌類化合物具有廣闊的應用前景。

根據本課題組研究成果顯示，在優化從北極海洋紅球菌B7740中提取類胡蘿卜素的同時，發現并鑒定出其能產生大量的甲基萘醌-8（menaquinone-8，MK-8）[22]。研究表明，植物源的類胡蘿卜素具有優異的抗氧化、抗增殖活性，但微生物紅球菌B7740產類胡蘿卜素和類異戊二烯醌的抗氧化活性目前還鮮見報道。因此，在本研究中，通過抗漂白能力、脂質氧化抑制能力和抗生物大分子（DNA、蛋白質）過氧化等方法測定紅球菌產物B7CIQE（含類胡蘿卜素、MK-8）的抗氧化活性。研究結果將有助于進一步探索其對癌癥、心血管疾病的預防作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp. B7740）凍干菌粉由浙江萬里學院提供；花生油 山東魯花集團有限公司；醋酸鋅、甲醇、二氯甲烷、氫氧化鉀、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl hydrazine，DNPH）、無水硫酸鈉、三氯乙酸、牛血清白蛋白、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽、2,2’-偶氮（2-甲基丙基脒）（2,2’-azobis(isobutyronitrile)，ABAP）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）、瓊脂糖、四氫呋喃、硫酸亞鐵、溴化乙錠、雙氧水、鹽酸、pBR322質粒、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT） 國藥集團化學試劑有限公司；溶菌酶（20 000 U/mg）、β-胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素（lycopene，Lyc）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG） 上海源葉有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲基叔丁基醚（色譜純） 上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

WH-3微型渦漩混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；EL-104電子天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；DK-98-II A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 日本Shimadzu公司；5810R臺式低溫離心機德國Eppendorf公司；RE-3000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；DSC204F1型差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀 耐馳儀器上海有限公司；Multiskan? GO 全波長酶標儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；0.22 μm有機濾膜、進樣瓶 國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素及類異戊二烯醌的提取

提取方法參考陳亞淑等[22]所作的描述。北極海洋紅球菌B7740經由酶法破壁，甲醇和二氯甲烷混合溶劑提取得到B7CIQE，測定其提取量，再將提取液經減壓旋轉蒸發后，充入氮氣封口保存。其在450 nm波長處有3 個吸收峰，確定B7CIQE為類胡蘿卜素，其中經液相色譜-質譜聯用鑒定出2 種甲基萘醌類類胡蘿卜素，MK-8（H2）和MK-8（H4）。B7CIQE的質量（m）根據公式（1）計算。

式中：A450nm代表提取液在450 nm波長處的吸光度；V代表提取液的體積/mL；F代表測定時稀釋的倍數。

1.3.2 β-胡蘿卜素抗漂白能力

本實驗參照Kuzina等[23]的方法。具體步驟如下，β-胡蘿卜素以0.2 mg/mL的質量濃度溶解于二氯甲烷中，取該溶液2 mL，與20 μL亞油酸、20 μL吐溫20混合后轉移至平底燒瓶中，并于40 ℃負壓懸蒸10 min。隨后向平底燒瓶中加入100 mL的去離子水。平均取5 mL溶液分裝于試管中，分別加入溶解于二氯甲烷的0.2 mL不同質量濃度的B7CIQE和陽性對照（BHT、Lyc、EGCG）溶液，并設空白（不加樣品，其余條件相同）對照，放置于50 ℃水浴，每隔15 min測一次470 nm波長處的吸光度，直到β-胡蘿卜素溶液顏色褪去。實驗重復3 次，取平均值。β-胡蘿卜素抗氧化抑制率根據公式（2）計算。

式中：AA代表氧化抑制率/%；A0代表樣品組初始吸光度；At代表時間t時樣品組的吸光度；A00代表空白組初始吸光度；A0

教師A在反思日志中提到了自己反思內容的困惑，教師A想要解決這些問題，但是由于各方面原因影響整體解決效果。

t代表空白組時間t時的吸光度。

1.3.3 脂質氧化穩定性

本實驗采用DSC進行脂質氧化穩定性的測定[24]。實驗在氮氣（60 mL/min）與氧氣（20 mL/min）的條件下進行，溫度范圍308.2～573.2 K（35～300 ℃），升溫速率為10.0 K/min。B7CIQE和植物來源類胡蘿卜素用花生油配成58 μg/mL的溶液。將分散好的溶液進行壓片，然后進行DSC測定。

1.3.4 類胡蘿卜素對蛋白質氧化的抑制作用

本實驗參照Cao[25]、Tian[26]等的方法。具體步驟如下，將100 μL類胡蘿卜素（分散在四氫呋喃中的不同濃度B7CIQE和植物來源類胡蘿卜素）與500 μL牛血清白蛋白（1 mg/mL）、200 μL FeSO4（5 mmol/L）、200 μL H2O2（80 mmol/L）在37 ℃下孵育0.5 h。反應結束后加入100 μL過氧化氫酶（0.5 mg/mL、3 000 U）終止反應。之后加入3 mL DNPH溶液，并在室溫下于暗室孵育1 h，且每10 min進行一次渦漩。反應結束后加入800 μL 10%（質量分數，下同）的三氯乙酸溶液來沉淀蛋白質，并將溶液在12 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。沉淀用體積比1∶1的乙醇和乙酸乙酯洗滌3 次，最后將沉淀物充分溶解在1 mL的鹽酸胍中。溶液的吸光度在370 nm波長處測定。蛋白質氧化抑制率根據公式（3）計算。式中：A對照代表對照組的吸光度；A空白代表空白組的吸光度；A樣品代表樣品組的吸光度。

1.3.5 DNA鏈斷裂保護實驗

本實驗參照Jung等[27]的方法。取10 μL pBR322（10 ng/μL）與10 μL 2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide,dihydrochloride，AAPH）（10 mmol/L）溶解在PBS中，在37 ℃條件下孵育1 h。取5 μL B7CIQE與植物來源的類胡蘿卜素在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中進行孵育。孵育結束后，取9 μL混合液，加入1 μL 10 倍十二烷基硫酸鈉DNA上樣液，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。各泳道加樣情況為：泳道1只添加pBR322溶液；泳道2添加pBR322和AAPH溶液；泳道3～8全部添加pBR322和AAPH溶液，并分別添加50～100 μg/mL B7CIQE溶液；泳道9～17全部添加pBR322和AAPH溶液，并分別添加50、75、100 μg/mL番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素溶液。凝膠最后用溴化乙錠染色，并在透射條件下進行觀察。

1.3.6 細胞培養

人肝癌細胞HepG2培養所用完全培養基為90%高糖培養基、10%的小牛血清、約1%的青霉素-鏈霉素，人口腔癌細胞KB所用完全培養基為90%高糖培養基、10%的胎牛血清、約1%的青霉素-鏈霉素。樣品和陽性對照全部溶解在含有0.1% DMSO的培養基中。

1.3.7 細胞內抗氧化實驗

紅球菌所產B7CIQE的細胞內抗氧化實驗根據文獻[28]所作描述，并略作一些調整。取處于對數生長期的HepG2細胞，用培養其所用的完全培養基稀釋至6×105個/mL，每孔100 μL，轉移至96 孔板；經過37 ℃、5% CO2、24 h培養，細胞貼壁以后，去掉培養基，并用100 μL的PBS洗每孔的細胞。接下來每孔加入不同質量濃度的樣品處理液和對照組，其中均含有25 μmol/L的2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽，同樣培養條件，繼續培養1 h，吸去全部液體，用100 μL的PBS分為清洗或者不清洗2 種處理方式，加入100 μL的含600 μmol/L ABAP的PBS以及對照組100 μL空白PBS，隨后將96 孔板放入熒光酶標儀，對其在37 ℃下進行掃描，測定條件為激發波長538 nm，發射波長485 nm，每5 min測試一次，持續1 h。細胞抗氧化活性根據公式（4）計算。抗氧化活性強弱通過半最大效應濃度（half maximal effective concentration，EC50）進行比較。

式中：∫SA表示不同質量濃度的樣品處理液時間-光密度曲線下的積分面積；∫CA表示時間-對照光密度曲線下的積分面積。

1.3.8 細胞毒性與抗癌細胞增殖活性測定

該實驗方法參照文獻[29-30]并略微調整。人口腔癌細胞KB和人肝癌細胞HepG2分別用完全培養基稀釋至0.6×105個/mL和 1×105個/mL，每孔100 μL，轉移至96 孔板。經過37 ℃、5% CO2、12 h培養，細胞貼壁以后，去掉上層培養基，每孔加入100 μL不同質量濃度的樣品處理液，對照組為完全培養基。同樣培養條件下，繼續培養24 h，使用PBS清洗每孔，使用噻唑藍法測其剩余活細胞數量，計算得其細胞毒性。光密度在490 nm波長處測定，每組做5 個復孔，實驗重復3 次。

1.4 統計分析

實驗結果使用SPSS軟件進行t檢驗和方差分析，并用Origin 8軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 抗漂白能力

圖1 β-胡蘿卜素氧化抑制率Fig. 1 Inhibition rates of β-carotene by B7CIQE and positive controls

從圖1可以看出，B7CIQE的抗漂白能力在實驗的4 種抗氧化劑中最強，相同質量濃度30 μg/mL下，抗氧化能力的順序為B7CIQE（70.20%）＞BHT（66.70%）＞EGCG（17.80%）＞番茄紅素（1.90%）。在2、5、12、15、30 μg/mL的不同質量濃度條件下，B7CIQE抗漂白能力隨著質量濃度的增大而增強。在30 μg/mL時，B7CIQE抗漂白能力要遠高于天然的β-胡蘿卜素。這可能是由于B7CIQE是由稀有的類胡蘿卜素和甲基萘醌組成，不飽和雙鍵含量較高，所以在抗氧化性上優于普通類胡蘿卜素和多酚類物質。

2.2 抗脂質氧化能力

DSC是一種常用于評價抗氧化劑抗油脂氧化的方法，油脂開始氧化溫度越高，說明抗氧化劑的抗氧化能力越強。從圖2可以看出，添加了B7CIQE的花生油開始氧化的溫度為175 ℃，后面依次為β-胡蘿卜素（165 ℃）、葉黃素（162 ℃）和番茄紅素（160 ℃）。從組成結構上推斷，B7CIQE具有較多數目的不飽和雙鍵，且其中萘醌母核具有較強的穩定性，所以相比其他3 種類胡蘿卜素具有最強的抗脂質氧化能力。

圖2 B7CIQE與植物源類胡蘿卜素抗脂質氧化的DSC熱流曲線Fig. 2 Non-isothermal DSC thermograms for peanut oils added with B7CIQE, lycopene, lutein or β-carotene

2.3 抑制蛋白氧化的能力

圖3 蛋白質體外氧化抑制率Fig. 3 Inhibitory effect in vitro of antioxidants on protein oxidation

為了分析B7CIQE對于蛋白質氧化抑制的效應，本實驗測定了添加B7CIQE和植物源性類胡蘿卜素的牛血清白蛋白的氧化損傷。圖3表明，蛋白質的氧化抑制率呈現出一致的質量濃度依賴性。在10 μg/mL的質量濃度下，B7CIQE對蛋白質氧化的抑制率（25.75%）比類胡蘿卜素（24.97%）、葉黃素（17.94%）、番茄紅素（10.40%）略高。隨著質量濃度的增加，B7CIQE的抑制率逐漸增加。在50 μg/mL的質量濃度下，與類胡蘿卜素（48.44%）、葉黃素（48.64%）、番茄紅素（44.80%）的抑制率相比，B7CIQE表現出最大的抑制率（57.20%）。

2.4 對DNA解鏈的保護作用

圖4 DNA鏈氧化斷裂圖Fig. 4 Agarose gel electrophoretogram showing the protection of B7CIQE against DNA damage

ABAP能造成超螺旋DNA解鏈甚至破碎。為了研究B7CIQE對于ABAP所致的DNA損傷的緩解效應，本實驗使用pBR322的DNA。在瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA的移動速率大于碎片化DNA。如圖4所示，上面亮帶表示解鏈或者破碎的DNA，下面暗帶表示超螺旋或者沒有受損的DNA。比較條帶1和2，ABAP孵化1 h后的超螺旋DNA完全解鏈或者破碎。條帶3～8顯示B7CIQE對于DNA損傷的抑制率有質量濃度依賴性。然而條帶9～17顯示，無論是50 μg/mL的低質量濃度，還是100 μg/mL的高質量濃度，植物內源物都不能防止DNA損傷。在本實驗中，B7CIQE顯示出對于DNA損傷保護的能力，為B7CIQE生物活性的研究提供參考。

2.5 細胞內抗氧化能力

鑒于單獨的蛋白質、脂質等抗氧化實驗結果受到細胞內部生化特性以及生物利用率等問題的影響，本實驗采用細胞內抗氧化的方法對紅球菌B7740所產B7CIQE的抗氧化活性進行測定。所得結果由EC50表示。為了探明B7CIQE與細胞膜的相互作用及細胞的攝入量，實驗設計了清洗和未清洗2 組。如圖5所示：未清洗時，EC50順序為B7CIQE（96.14 μg/mL）＜番茄紅素（155.98 μg/mL）＜葉黃素（186.47 μg/mL）＜β-胡蘿卜素（199.81 μg/mL）；清洗時，EC50順序為B7CIQE（182.86 μg/mL）＜β-胡蘿卜素（260.25 μg/mL）＜葉黃素（287.57 μg/mL）＜番茄紅素（295.09 μg/mL）。B7CIQE與常見高等植物來源類胡蘿卜素相比，其EC50均較小。該結果顯示，B7CIQE因含有甲基萘醌類稀有類胡蘿卜素，具有比高等植物來源類胡蘿卜素更高的細胞膜滲透性，所以B7CIQE在細胞中具有較高的攝入量以及抗氧化活性。

圖5 B7CIQE與植物源類胡蘿卜素細胞內抗氧化EC50Fig. 5 Cellular antioxidant activity of B7CIQE and plant-derived carotenoids

2.6 細胞毒性與抗增殖活性

如圖6所示，實驗結果用EC50表示，較低的EC50表示其較高的抗增殖能力。B7CIQE與常見植物來源類胡蘿卜素都表現了抗增殖活性與質量濃度的相關性。人肝癌細胞HepG2抗增殖實驗結果表明，葉黃素具有最低的EC50（20.86 μg/mL），其次為β-胡蘿卜素（124.88 μg/mL）、B7CIQE（126.34 μg/mL）、番茄紅素（139.24 μg/mL）。人口腔癌細胞KB抗增殖實驗結果表明，B7CIQE具有最強的抗KB細胞增殖活性，其EC50最低（25.14 μg/mL），其次為葉黃素（64.29 μg/mL）、番茄紅素（69.87 μg/mL）、β-胡蘿卜素（149.16 μg/mL）。在實驗質量濃度下，B7CIQE對HepG2和KB細胞均未有明顯的細胞毒性（HepG2細胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為（311.92±36.01）μg/mL，KB細胞的IC50為（163.95±17.34）μg/mL），表明B7CIQE抑制HepG2和KB細胞增殖活性不是由其細胞毒性引起。

圖6 B7CIQE與植物源類胡蘿卜素抗HepG2與KB細胞增殖能力Fig. 6 Antiprolitferative activities of B7CIQE and plant-derived carotenoids against HepG2 human liver cancer and KB human oral cancer cells

自由基主要通過損傷脂質、蛋白質、DNA以及改變細胞間信號通路等作用對機體造成損害。脂質與蛋白質氧化與許多疾病相關，如糖尿病、子癇、慢性腎功能衰竭、自身免疫性疾病等。DNA是氧化應激的模態損傷靶點，最終導致癌癥的發生。根據實驗結果，初步判斷了B7CIQE的抗氧化活性。在氧化反應特別是生物大分子的氧化反應中，B7CIQE顯示出了優良的抗氧化活性。除此之外，B7CIQE在細胞內的抗氧化活性以及細胞利用率都較高，對于HepG2和KB細胞都表現了良好的抗增殖活性。

3 結 論

β-胡蘿卜素漂白實驗結果顯示，B7CIQE具有抗漂白能力，且隨著質量濃度的增大其抗漂白能力逐漸增強，在30 μg/mL時，B7CIQE抗漂白能力要遠大于天然的β-胡蘿卜素。脂質氧化穩定性實驗結果顯示，B7CIQE相比β-胡蘿卜素、葉黃素和番茄紅素具有最強的抗脂質氧化能力。對蛋白質氧化的抑制實驗結果顯示，與β-胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素相比，B7CIQE對蛋白質氧化有很強的抑制作用，且隨著質量濃度增加抑制作用增大。DNA鏈斷裂保護實驗結果顯示，B7CIQE對DNA損傷具有保護的作用。細胞內抗氧化實驗結果顯示，B7CIQE在細胞中具有較高的攝入量以及抗氧化活性，與常見高等植物來源類胡蘿卜素相比，其EC50均較小。細胞毒性與抗增殖活性實驗結果顯示，B7CIQE與常見植物來源類胡蘿卜素對人肝癌細胞HepG2和人口腔癌細胞KB都表現了抗增殖活性與質量濃度的相關性，且B7CIQE具有最強的抗KB細胞增殖活性。

綜合實驗結果表明，北極海洋紅球菌B7740所產B7CIQE與常見高等植物來源類胡蘿卜素相比，具有較高的抗氧化活性和抗增殖活性。同時，紅球菌B7740所產B7CIQE的分離純化、工業化生產、應用等也需要深入研究。

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