富硒玉米肽對撲熱息痛致小鼠肝損傷的防護作用

趙娟娟，熊匯竹，劉維維，石 文，何 慧*

（華中農業大學食品科學技術學院，環境食品學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070）

撲熱息痛（acetaminophen，APAP）是應用最廣泛的解熱鎮痛藥，采用治療劑量時是安全的，但是急性或蓄積性地過量使用則會導致嚴重的肝損傷，并有可能進一步發展成肝衰竭[1]。藥物代謝動力學研究表明，在正常情況下，APAP進入體內后大部分在肝臟中經尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸轉移酶（uridine diphosphatedependent glycosyltransferase，UGT）和磺基轉移酶（sulfotransferase，SULT）的作用，分別與葡萄糖醛酸和硫酸結合后，代謝為無毒化合物——APAP-葡萄糖醛酸酯和APAP-硫酸鹽，繼而由膽汁和腎臟排出；另有少量在細胞色素P450酶系的參與下，代謝為毒性物質N-乙酰-對-苯醌亞胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI）[2]。在治療劑量下，NAPQI與谷胱甘肽（glutathione，GSH）結合，形成半胱氨酸衍生物和硫醇尿酸而解毒。若給予過量的APAP，生成的NAPQI超過體內GSH能處理的量時，可造成機體內NAPQI堆積，NAPQI具有親電性和很強的氧化作用，可與肝細胞內核酸、蛋白質共價結合，使生物膜系統發生脂質過氧化[3-4]，引起肝細胞壞死[5-7]。此外，APAP致肝損傷的機制還與氧化應激及炎癥反應有關。因此，可抑制細胞色素P450酶活性，減少APAP通過細胞色素P450酶的代謝[8-9]，增加機體GSH含量和抗氧化能力，均有緩解或預防APAP引起的肝損傷的作用[10-12]。水飛薊素是一種有效的抗氧化劑，可通過保護肝細胞膜，促進肝細胞的自我修復及再生等作用發揮保肝功效，是目前世界上發現的最具肝臟疾病療效的類黃酮物質。

本實驗室先前的研究發現，富硒玉米肽（seleniumenriched corn peptides，SeCPs）可以提高機體GSH的供應量，且具有抗氧化活性及保護肝臟的作用[13]，至于SeCPs是否具有拮抗APAP致肝損傷的作用目前鮮有報道，故本研究采用APAP致小鼠肝損傷模型，通過考察SeCPs對代謝APAP各相關酶指標的影響及觀察小鼠肝臟病理學變化，以期闡明SeCPs對APAP致肝損傷模型鼠的保護作用，并分析其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料及試劑

昆明種雄性小鼠，體質量（20±2）g，SPF級，購于湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心。許可證號：SCXK（鄂）2011-0012。

富硒玉米通過在玉米植株葉面噴施硒肥得到，硒含量為2.192 mg/kg；SeCPs實驗室自制（分子質量小于5 kDa，肽含量為95.05%，有機硒含量32.37 mg/kg）；堿性蛋白酶（Alcalase 3.0 T，24萬 U/g） 丹麥諾維信公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3，純度≥98%） 德國Sigma-Aldrich公司；水飛薊素膠囊 德國馬博士大藥廠；對乙酰氨基酚片 北京曙光藥業有限責任公司；谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒南京建成生物工程研究所；細胞色素P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）、細胞色素P4501A2（cytochrome P4501A2，CYP1A2）、谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、UGT、SULT試劑盒 上海源葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ML20型電子天平、FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；TDZ5-W臺式低速離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Microfuge 20R高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司；LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；Laborota 4000 eきcient旋轉蒸發器 德國Heidolph公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 武漢亨泰達儀器設備有限公司；全波長酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；MWCO 5 kDa再生纖維素卷式膜包（有效膜面積0.09 m2） 美國Millipore公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；AFS-822型原子熒光光度計北京吉天儀器有限公司；DM3000熒光顯微鏡 徠卡儀器（德國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米肽的制備

玉米籽粒磨碎得玉米粉，以1∶13（m/V）的比例加入堿醇液（0.1 mol/L NaOH與體積分數95%乙醇的比例1∶1，V/V），于45 ℃下水浴攪拌提取2 h，離心得上清液，調pH值至6.3左右，靜置并離心，所得沉淀凍干即為玉米蛋白粉。取適量玉米蛋白粉，按1∶35（m/V）的比例加入蒸餾水，在60 ℃，pH 8.0的條件下用堿性蛋白酶（酶與底物比值為0.6%，m/m）在恒溫加熱磁力攪拌器中酶解4 h。將所得酶解液進行超濾，取分子質量小于5 kDa的產物，濃縮，冷凍干燥，得SeCPs，硒含量為32.37 mg/kg，保存于干燥器中備用。

1.3.2 動物分組及模型的建立

將70 只體質量為（20±2）g的昆明種雄性小鼠隨機分成7 組，每組10 只，分別為正常對照組、APAP模型組、水飛薊素陽性對照組（50 mg/kg mb）、玉米肽組（corn peptides，CPs。400 mg/kg mb）、亞硒酸鈉組（Na2SeO3，28.36 μg/kg mb）、亞硒酸鈉+玉米肽組（Na2SeO3+CPs，28.36 μg/kg mb+400 mg/kg mb）、SeCPs組（SeCPs，400 mg/kg mb），其中玉米肽組、亞硒酸鈉+玉米肽組及富硒玉米肽組的肽含量相同，亞硒酸鈉組、亞硒酸鈉+玉米肽組及SeCPs組的硒含量相同。各組均以小鼠標準飼料喂養，自由飲水。室溫25 ℃下適應7 d后，開始灌胃，每天灌胃1 次，正常對照組和模型組每日灌胃等劑量生理鹽水，小鼠每兩天稱1 次體質量，連續灌胃14 d。于第15天，小鼠禁食12 h，按上述劑量灌胃1次，2 h后，除正常組外其余組均腹腔注射280 mg/kg mbAPAP的水溶液（于40 ℃水浴加熱），正常組小鼠腹腔注射等劑量的生理鹽水。小鼠再禁食12 h后，眼眶取血，脫臼處死后取肝臟做相關檢測。

1.3.3 小鼠肝臟指數的計算

小鼠肝臟指數的計算按照下式進行。

1.3.4 小鼠各項生化指標的測定

小鼠血液離心后取上清液，按試劑盒說明書操作步驟進行AST活力的測定。小鼠肝臟用生理鹽水制備成質量分數10%的肝勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明書操作步驟進行CYP2E1、CYP1A2、GST、UGT質量濃度，SULT、GSH-Px活力及GSH含量的測定。

1.3.5 組織病理學HE染色觀察

切取小鼠肝臟1 cm3左右，立即用體積分數4%的多聚甲醛溶液固定，進行常規石蠟包埋切片，厚度5 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，于熒光顯微鏡下觀察肝組織的變化，并進行圖像采集。

1.4 數據處理

實驗數據使用SPSS 17.0統計軟件，采用Duncan法進行顯著性分析處理，實驗結果以表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SeCPs對小鼠肝臟指數的影響

肝損傷小鼠因其肝臟腫大，導致肝臟指數增大，故模型組小鼠的肝臟指數顯著高于正常對照組（表1），CPs組、SeCPs組及CPs+Na2SeO3組均可以顯著降低小鼠肝臟指數；水飛薊素陽性對照組及Na2SeO3組小鼠的肝臟指數雖有所降低，但與模型組相比尚未達統計學差異（P＞0.05）。

表1 SeCPs對小鼠肝臟指數的影響（n＝10）Table 1 Effects of SeCPs on liver index of mice (n= 10)

2.2 SeCPs對小鼠血清中AST活力及肝勻漿中CYP2E1、CYP1A2質量濃度的影響

AST是指示肝損傷的靈敏指標，在肝細胞受損時，會從細胞內溢出進入血液，使血液中AST活力大幅度上升，CYP2E1及CYP1A2參與APAP的代謝并生成肝毒性物質，當大量APAP攝入時，機體的自我保護作用會使得肝臟中CYP2E1和CYP1A2的質量濃度下降。

圖1 SeCPs對小鼠血清中AST活力的影響（n＝10）Fig. 1 Effects of SeCPs on serum AST activity in mice (n = 10)

圖2 SeCPs對小鼠肝勻漿中CYP2E1、CYP1A2質量濃度的影響（n＝10）Fig. 2 Effects of SeCPs on CYP2E1 and CYP1A2 levels in liver homogenate of mice (n = 10)

如圖1、2所示，與正常對照組相比，模型組小鼠血清中AST活力顯著上升（P＜0.05），肝勻漿中CYP2E1質量濃度顯著下降（P＜0.05），CYP1A2質量濃度有所降低，但尚未達到顯著性水平（P＞0.05）；相比于模型組，陽性對照物水飛薊素可顯著性降低血清中AST活力及肝勻漿中CYP2E1和CYP1A2的質量濃度；CPs組小鼠血清AST活力及肝勻漿中CYP1A2質量濃度明顯降低，效果與水飛薊素相當，但CPs對CYP2E1的質量濃度沒有顯著影響；Na2SeO3顯著降低了血清中AST活力，使肝勻漿中CYP1A2質量濃度雖然有所降低，但未達顯著水平，而對CYP2E1的質量濃度無顯著影響；CPs+Na2SeO3組可明顯降低小鼠血清AST及肝勻漿中CYP2E1和CYP1A2的質量濃度，且效果優于CPs組及Na2SeO3組，差異顯著（P＜0.05）；SeCPs可大幅度降低AST活力以及CYP2E1、CYP1A2質量濃度，且對血清AST活力和肝勻漿中CYP1A2質量濃度的降低作用顯著優于CPs+Na2SeO3，與其他給藥組相比，SeCPs表現出了最佳的抑制肝毒性物質產生的作用。

2.3 SeCPs對小鼠肝勻漿中GST質量濃度、GSH-Px活力及GSH含量的影響

圖3 SeCPs對小鼠肝勻漿中GSH-Px活力的影響（n＝10）Fig. 3 Effects of SeCPs on GSH-Px activity in liver homogenate of mice (n = 10)

圖4 SeCPs對小鼠肝勻漿中GST質量濃度及GSH含量的影響（n＝10）Fig. 4 Effects of SeCPs on GST and GSH levels in liver homogenate of mice (n = 10)

有毒代謝產物NAPQI與GSH的結合解毒過程需要GST的催化，而GSH-Px是有效的抗氧化酶，硒是其活性中心。如圖3、4所示，模型組小鼠肝臟中GSH-Px活力及GSH含量較正常對照組顯著性降低，GST質量濃度有所降低，但未達到顯著水平；與模型組相比，CPs顯著提高了GSH含量及GSH-Px活力，部分提高GST質量濃度；Na2SeO3僅顯著性提高了GSH-Px活力，效果優于CPs，但沒有達到顯著性水平，這源于硒是GSH-Px的重要組成部分；CPs+Na2SeO3對這3 種物質均起到了正向調節作用，且對GSH含量的增加顯著性高于Na2SeO3組，對GSH-Px活力的提升作用顯著性優于CPs；SeCPs相比于CPs+Na2SeO3對這3 種物質的正向調節作用進一步大幅增加（P＜0.05）。由此可見，單純補充無機硒或CPs，無法有效提高或只能部分提高機體排出有毒物質NAPQI能力，同時補充CPs和無機硒，可進一步提升機體的解毒能力，而補充SeCPs，其對機體解毒能力的提升作用在CPs+Na2SeO3的基礎上又有大幅提升（P＜0.05），提示SeCPs中CPs與有機硒具有協同保肝作用。

2.4 SeCPs對小鼠肝勻漿中UGT質量濃度及SULT活力的影響

APAP進入體內后大部分經UGT及SULT催化，與葡萄糖醛酸及硫酸結合，最終以無毒的酯或鹽的形式排出體外，這兩種酶質量濃度或活力的變化將會影響APAP在體內不同代謝途徑處理量。

圖5 SeCPs對小鼠肝勻漿中UGT質量濃度及SULT活力的影響（n＝ 10）Fig. 5 Effects of SeCPs on UGT content and SULT activity in liver homogenate of mice (n = 10)

由圖5可以看出，模型組小鼠肝臟中UGT質量濃度及SULT活力較正常對照組均顯著下降；而相比于模型組，CPs可顯著性降低小鼠肝臟中UGT質量濃度，Na2SeO3對UGT的質量濃度及SULT的活力均無顯著影響，CPs+Na2SeO3可顯著性降低UGT質量濃度及SULT活力，但SeCPs對這兩種酶的抑制作用較CPs+Na2SeO3又明顯增大，提示SeCPs等可通過降低UGT質量濃度及SULT活力，從而降低APAP在體內的代謝。

2.5 SeCPs對小鼠肝組織的病理學影響

由圖6可知，正常對照組小鼠肝臟結構完整，小葉輪廓清晰，肝細胞索呈明顯的放射狀排列，無肝細胞壞死現象，細胞形狀規則，核結構清晰可見；模型組小鼠肝臟結構破壞嚴重，有明顯的灶狀壞死現象，肝細胞索排列呈紊亂狀，且細胞壞死嚴重；相比于模型組，水飛薊素組小鼠肝組織病理變化得到顯著改善，表現為肝細胞壞死現象明顯減少，大部分肝細胞索仍存在，但仍有部分點狀壞死；Na2SeO3組小鼠肝臟病變仍比較嚴重，但灶狀壞死面積有所減小；CPs組小鼠肝臟灶狀壞死面積進一步減小，肝細胞壞死現象也得到緩解；CPs+Na2SeO3組小鼠肝臟病變明顯改善，肝細胞再生明顯，細胞索紊亂現象減輕，灶狀壞死范圍明顯減小；SeCPs組小鼠肝臟的病理變化僅表現為有輕微的點狀壞死及部分肝細胞壞死，相比于模型組及其他給藥組，其肝臟情況良好。

圖6 小鼠肝組織HE染色（×200）Fig. 6 HE staining of liver slices of mice (× 200)

3 討 論

近年來，隨著藥物品種的不斷增加，藥物性肝損害的發生率亦相應增加。常見的能引起肝損傷的藥物主要有APAP[14-17]、咪唑硫嘌呤、阿霉素、環保霉素及抗結核藥物等[18]，而在美國和英國，APAP過量是肝損傷最常見的原因[19]。APAP致肝損傷模型被廣泛用于藥物性肝損傷的機制研究及藥物保肝作用的評價[20]。很多研究已經表明，一些天然活性產物具有防治藥物性肝損傷的功能作用。本實驗采用APAP致小鼠肝損傷的模型研究SeCPs對其的防護作用。研究結果顯示，小鼠腹腔注射280 mg/kg mb的APAP后，引起嚴重的肝損傷，而SeCPs可以通過多種方式拮抗APAP的肝毒性。首先，SeCPs可顯著性降低小鼠肝臟中CYP1A2及CYP2E1的質量濃度，而CYP1A2和CYP2E1是代謝APAP產生毒性產物的主要酶系[21]。在嚙齒動物實驗中發現，CYP2E1和CYP1A2基因敲除小鼠對于APAP肝毒性的耐受明顯高于野生小鼠[22]，提示降低CYP2E1和CYP1A2的表達水平，可減少有毒代謝產物NAPQI的產生，對于抗APAP的肝毒是有利的。其次，在本研究中，各給藥組相對于模型組其SULT活力顯著降低，SeCPs組更為顯著，各組UGT質量濃度測定結果也與此相似，即APAP經UGT、SULT催化代謝這一途徑被抑制。Yao等[23]研究發現，在大鼠的飼料中摻入表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG），可以降低其肝臟中APAP-葡萄糖醛酸酯的含量，降低幅度達到42%，即EGCG抑制了APAP致肝損傷大鼠肝微粒體內UGT的活性。另外，大鼠進食茶多酚后，其盲腸中由微生物產生的能分解APAP-葡萄糖醛酸酯的β-葡萄糖醛酸酶的活性降低[24]。由此推斷，SeCPs可能也發揮了類似作用，即通過降低腸中分解APAP-葡萄糖醛酸酯相關酶的活性，減少APAP在肝腸循環通路中的重吸收，降低了肝臟中APAP的濃度，從而減小其肝臟毒性。早在20世紀90年代已有研究表明，阿魏酸通過增加APAP致肝損傷小鼠體內GST活性及GSH含量，起到保肝作用[25]，表明此為有效防護APAP致肝損傷的途徑。乙酰紫堇靈能顯著減少小鼠由APAP引起的肝臟GSH耗竭，降低血中APAP的濃度，其對肝臟CYP450總量及GST活力有明顯誘導作用，而對代謝APAP的CYP450同工酶——CYP2E1活力卻有抑制作用，說明乙酰紫堇靈對小鼠APAP肝損傷的防護作用與其選擇性地調節CYP450同工酶，誘導GST，加快機體對APAP的解毒代謝作用密切相關[26]。此外，在APAP引起肝損傷的過程中，活性氧產生于線粒體，它會損傷線粒體功能，影響細胞信號傳導，并促使細胞死亡，有研究表明，線粒體的靶向抗氧化劑是治療過量APAP引起肝損傷的有效藥物，將現有的藥物針對性地用于抵抗氧化應激及緩解由活性氧引起的其他并發癥狀，使其有可能用于過量服用APAP病人的治療中[27]。而有毒代謝物NAPQI的形成會使機體內的GSH處于很低的水平，這樣會大幅度抑制GSH-Px的抗氧化解毒作用[28]，因此，增加機體GST活力及GSH的含量格外重要。本研究中，SeCPs不僅能夠大幅度逆轉由過量APAP引起的GST質量濃度及GSH含量下降的現象，還可以顯著性提高GSH-Px的活力，且相比于模型組，其提高幅度高達48.4%，雖然Na2SeO3也可顯著提高小鼠肝臟中GSH-Px的活力，但效果不及SeCPs，其中有機硒的貢獻功不可沒，說明有機硒更利于機體吸收，有更好的生理活性。此外，小鼠肝臟HE染色觀察結果也顯示，SeCPs可以有效地逆轉由APAP引起的肝臟病理變化，佐證了其優異的保肝作用。

綜上所述，其一，SeCPs可以降低肝臟中UGT質量濃度及SULT的活力，抑制APAP的代謝；其二，SeCPs能有效地降低小鼠肝臟中CYP2E1及CYP1A2的質量濃度，減少有毒物質的產生；其三，SeCPs可提高GST質量濃度及GSH的含量，提高機體排出有毒代謝物的能力，且其對GSH-Px活力的提升作用又加強了機體的抗氧化應激能力。故SeCPs是通過上述3 個方面的共同作用，有效地保護肝臟，減弱APAP的肝毒對機體的侵害。

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