秋水仙素誘導(dǎo)馬鈴薯野生種S.acaule多倍體的初步研究

張艷萍 蒲秀琴

（青海省農(nóng)林科學(xué)院/教育部青藏高原生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

種質(zhì)資源是作物遺傳改良的基礎(chǔ)，馬鈴薯在其起源中心有著豐富的野生種和馬鈴薯原始栽培種，是改良現(xiàn)有品種的寶貴資源。馬鈴薯野生種因其長(zhǎng)期生長(zhǎng)在野外，對(duì)不良環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和抵御能力，含有多種逆境抗性基因，具有優(yōu)良的抗病蟲(chóng)害能力，對(duì)病毒病有較高抗性甚或免疫[1]；許多野生種具有普通栽培種缺乏的優(yōu)良品質(zhì)性狀[2-4]。野生馬鈴薯特異性狀的發(fā)掘和研究，對(duì)于從中獲得優(yōu)良品質(zhì)性狀和抗性基因，持續(xù)改良現(xiàn)有栽培種具有十分重要的意義。

馬鈴薯野生種因大部分為二倍體種而很難與為四倍體的普通栽培種進(jìn)行雜交，要解決這一障礙，一種方法是誘導(dǎo)普通栽培種產(chǎn)生雙單倍體，另一種方法是通過(guò)人工誘導(dǎo)而使野生種染色體加倍，從而可以與普通栽培種進(jìn)行雜交。利用秋水仙素加倍馬鈴薯染色體的方法，常用的是幼芽液滴涂抹法[5]，而建立在完整的植物再生體系基礎(chǔ)上的離體誘導(dǎo)具有誘導(dǎo)環(huán)境更容易控制，試驗(yàn)結(jié)果易于重復(fù)的優(yōu)勢(shì)，而且試驗(yàn)所得到的多倍體植株更易于篩選和保存。雷家軍等[6]用不同濃度的秋水仙素處理組培苗的莖尖，建立了草莓莖尖加倍的技術(shù)體系；楊麗娟等[7]在離體培養(yǎng)條件下，以大花蕙蘭原球莖為材料，利用秋水仙素誘導(dǎo)大花蕙蘭產(chǎn)生多倍體。

馬鈴薯野生種S.acaule（無(wú)莖薯）是改良馬鈴薯耐凍性的重要基因資源[8]，原產(chǎn)于南美，為四倍體種，但其胚乳平衡數(shù)為2，只能與二倍體種雜交，與栽培種雜交時(shí)必須先將染色體加倍。本試驗(yàn)以馬鈴薯野生種S.acaule無(wú)菌苗帶腋芽莖段為誘導(dǎo)材料，就秋水仙素誘導(dǎo)濃度及處理時(shí)間對(duì)多倍體誘導(dǎo)結(jié)果加以分析，以期建立秋水仙素誘導(dǎo)馬鈴薯莖段染色體加倍的離體誘導(dǎo)體系，為野生馬鈴薯資源的充分利用創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 馬鈴薯野生種S.acaule擴(kuò)繁20d后幼苗帶腋芽莖段，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為馬鈴薯莖段扦插擴(kuò)繁培養(yǎng)基，光照強(qiáng)度2000Lx，光照時(shí)長(zhǎng)16h/d，溫度 20～25℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 浸泡法 將野生種S.acaule帶腋芽莖段轉(zhuǎn)移到已滅菌處理，濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%的秋水仙素溶液中，浸泡12h、24h和36h，以無(wú)菌水為對(duì)照，共10個(gè)處理，每個(gè)處理20株，3次重復(fù)。處理后用無(wú)菌水清洗，接種到擴(kuò)繁培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)。20d后觀察莖段生根成苗情況，統(tǒng)計(jì)存活率；待根長(zhǎng)約1.5cm時(shí)取根尖進(jìn)行倍性鑒定，計(jì)算變異率。

1.2.2 混合培養(yǎng)法 將野生種S.acaule帶腋芽莖段轉(zhuǎn)接到分別添加了0.1%、0.3%和0.5%的秋水仙素溶液的繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d、14d和21d，以普通繼代培養(yǎng)基為對(duì)照，共10個(gè)處理，每個(gè)處理20株，3次重復(fù)。處理后轉(zhuǎn)入普通繼代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。20d后觀察莖段生根成苗情況，統(tǒng)計(jì)存活率；待根長(zhǎng)約1.5cm時(shí)取根尖進(jìn)行倍性鑒定，計(jì)算變異率。

1.2.3 染色體倍性鑒定 采用根尖細(xì)胞染色鏡檢的方法，剪取誘導(dǎo)生成的組培苗幼嫩根尖0.3～0.5cm，用0.002mol/L的8-羥基喹啉預(yù)處理3h；將預(yù)處理后的材料用清水洗2遍，然后放入卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中，4℃下固定24h；棄去固定液，將根尖置于60℃恒溫水浴中，用1mol/L鹽酸酸解10min，然后用蒸餾水洗3次；制片前用45%醋酸軟化根尖1min左右，用改良碳酸品紅染色5min后進(jìn)行壓片，鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素濃度及處理時(shí)間對(duì)馬鈴薯野生種莖段多倍體誘導(dǎo)的影響

2.1.1 浸泡法 從表1可以看出，誘導(dǎo)莖段在不同濃度秋水仙素溶液中浸泡規(guī)定時(shí)間后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，都有一定比例莖段發(fā)根成苗。隨著秋水仙素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率呈降低趨勢(shì)，但變異率呈先增大后減小趨勢(shì)。在秋水仙素濃度為0.3%、浸泡36h時(shí)莖段的變異率最高，為15.0%；在秋水仙素濃度為0.1%時(shí)，浸泡12h與24h變異率均為0。

表1 秋水仙素溶液浸泡對(duì)莖段誘導(dǎo)加倍的效果

經(jīng)秋水仙素浸泡的帶腋芽莖段在轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基后生長(zhǎng)較對(duì)照緩慢，大約15d后才開(kāi)始生根，浸泡濃度越高，生長(zhǎng)越緩慢。可見(jiàn)，秋水仙素對(duì)莖段存在一定的毒害作用，且濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)毒害作用越大，對(duì)腋芽的發(fā)根成苗具有一定的抑制作用。

2.1.2 混合培養(yǎng)法 從表2可看出，在繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度的秋水仙素溶液共同培養(yǎng)，隨著秋水仙素濃度的增加和共同培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率呈下降趨勢(shì)；但變異率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，并在秋水仙素濃度為0.3%、共培養(yǎng)時(shí)間為14d時(shí)變異率最大為31.6%。當(dāng)秋水仙素濃度為0.5%時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率明顯降低，變異率也在降低。由此可見(jiàn)，要想獲得較高的變異率必須是適宜的秋水仙素濃度與處理時(shí)間結(jié)合起來(lái)。

表2 秋水仙素溶液混合培養(yǎng)對(duì)莖段誘導(dǎo)加倍的效果

混合培養(yǎng)法中莖段處理后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基成苗存活率較浸泡法低，表明在繼代培養(yǎng)基中添加秋水仙素共同培養(yǎng)對(duì)莖段的毒害作用較浸泡法大，但變異率較浸泡法的高。

2.2 多倍體鑒定 形態(tài)鑒定初步篩選組培苗葉片變厚、莖變粗、節(jié)間變短的植株為變異株，單株切取帶腋芽莖段轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基25d后進(jìn)行染色體鑒定，分別切取四倍體野生種S.acaule和形態(tài)鑒定為變異株的根尖2～3mm進(jìn)行染色體制片，并在熒光顯微鏡下鏡檢。觀察顯示，四倍體的染色體數(shù)目為2n=4x=48，變異株染色體觀察中發(fā)現(xiàn)，大部分變異株為嵌合體，即細(xì)胞中既有四倍體細(xì)胞，也有六倍體細(xì)胞，還有八倍體細(xì)胞，87株變異株通過(guò)鏡檢獲得2株八倍體植株。

3 結(jié)論與討論

秋水仙素的作用是抑制細(xì)胞分裂中期紡錘絲的合成，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成2個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍。自1937年A.F.Blakeslee等人利用秋水仙素處理曼陀羅獲得多倍體后，秋水仙素就被公認(rèn)為是最好的誘導(dǎo)植物多倍體的化學(xué)藥劑[9]，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)和植物育種的工作。但秋水仙素對(duì)外植體的毒害作用大，并與處理濃度和處理時(shí)間成正比，過(guò)高的濃度反而會(huì)降低誘導(dǎo)變異率。在試驗(yàn)中獲得的變異植株在繼代增殖過(guò)程中也有白化死亡現(xiàn)象發(fā)生。

本試驗(yàn)中以馬鈴薯野生種S.acaule無(wú)菌苗帶腋芽莖段為誘導(dǎo)材料，采用秋水仙素溶液浸泡法和混合培養(yǎng)法2種處理方式均可獲得倍性變異植株，同一濃度時(shí)，混合培養(yǎng)法較浸泡法能獲得較高的變異率。在誘導(dǎo)材料和誘導(dǎo)方法確定時(shí)，篩選秋水仙素溶液最適誘導(dǎo)濃度和處理時(shí)間的組合是獲得高變異率的關(guān)鍵。試驗(yàn)結(jié)果表明在繼代增殖培養(yǎng)基中添加濃度為0.3%的秋水仙素，共同培養(yǎng)時(shí)間為14d時(shí)獲得誘導(dǎo)變異率最大為31.6%。

嵌合體是秋水仙素誘導(dǎo)多倍體研究中普遍發(fā)生的現(xiàn)象，不經(jīng)分離穩(wěn)定會(huì)產(chǎn)生回復(fù)突變，如何有效地篩選及分離嵌合體還需進(jìn)一步開(kāi)展研究。馬鈴薯同源多倍體的開(kāi)花結(jié)實(shí)性狀也有待進(jìn)一步探討。

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