針刺“足三里”對免疫抑制大鼠的作用及穴區CGRP表達影響的研究*

代巧妹，王美嶠，顏培宇，2△，尚艷琦，梁 慧，蔡文輝，王 垚

(1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040;2.澳門科技大學，中國 澳門 519020)

足三里為胃經合穴，有補益脾胃、調和氣血、祛邪防病之功。對針刺腧穴的作用機理研究證明：腧穴作用中的“調和氣血”即包括了現代解剖學中的淋巴系統[1-4]。有報道針刺可以調整人體白細胞總數，使之趨向正常；家兔動物實驗亦證實針灸足三里穴對白細胞總數有一定影響，且中性粒細胞的變化與白細胞總數的變化呈平行關系。另有研究顯示針刺足三里治療瘧疾可以使淋巴細胞的轉化率提高[5]。這些研究表明足三里穴可能對免疫系統產生一定作用，但缺乏相關動物實驗研究的進一步證實。皮膚重要神經遞質的降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)與表皮和真皮內的多種靶細胞接觸，可直接影響皮膚內重要的具有抗原提呈功能的樹枝狀細胞-郎格漢斯細胞以及微血管內皮細胞的功能。針刺調節神經末梢CGRP的釋放，與針刺的神經保護、抗缺血、調節血壓、調節胃腸運動、保護胃黏膜、免疫調節、鎮痛作用等均有密切聯系，這些研究結果提示CGRP可能參與針刺效應，而這種效應在不同的疾病中會引起不同靶器官效應[6-8]。在本研究中，筆者用免疫抑制劑環磷酰胺建立免疫抑制大鼠模型，使用傳統針刺和電針兩種方法針刺大鼠足三里穴，并研究局部穴區CGRP變化，從而揭示針刺治療疾病的作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康SD雄性大鼠30只，體質量280～350 g。由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：scxk(京)2007-0001。

1.2 藥品和試劑

Super M-MLV反轉錄酶(北京百泰克生物技術有限公司)，RNA simple Total RNA Kit(天根生化科技北京有限公司)，環磷酰胺(上海谷研實業有限公司)，2×Power Taq PCR MasterMix(北京百泰克生物技術有限公司)，RNase固相清除劑(北京天恩澤基因科技有限公司)，引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.3 儀器

電針儀(汕頭市醫用設備廠)，凝膠成像分析儀(北京六一生物科技有限公司)，水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，PCR儀(杭州博日科技有限公司)，ADVIA 120血球分析儀(德國西門子公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗分組及造模

正常SD雄性大鼠30只，隨機分為正常組、假手術組、模型組、針刺組和電針組共5組，每組各6只。正常組小鼠不做任何處理，假手術組腹腔注射0.9%無菌生理鹽水3天，第4天加強注射1次。其余各組均腹腔注射新鮮配制的環磷酰胺注射液(50 mg/kg)，連用3天，第4天加強注射1次，制備免疫抑制模型[9]。

2.2 針刺選穴及針刺操作方法

根據華興邦《大鼠穴位針灸圖譜》，取 “足三里”穴。針具選擇30號針，進針3 mm。針刺手法：補法(重插輕提、徐徐捻轉、吸氣時進針)[8]。針刺組施行補法治療，留針30 min，每日1次。電針組給予電針補法治療，連續波，頻率20 Hz，強度1～2 mA，持續30 min，每日1次。實驗各組大鼠綁縛固定操作，正常組、假手術組及模型組分別綁縛但不針刺，治療7天。

2.3 測定白細胞計數

大鼠尾靜脈取血，用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑，用ADVIA-120 血球分析儀檢測白細胞計數。

2.4 測定脾臟、胸腺指數

各組大鼠稱重，無菌取大鼠脾與胸腺，稱重，根據文獻計算脾臟與胸腺指數[9]。

2.5 總RNA提取及cDNA的制備

治療結束后，處死大鼠，取“足三里”區大約皮下10 mm×3 mm區域組織，迅速冷凍于液氮瓶。研砵預冷，加入液氮充分研磨組織，待組織呈粉末狀加入1 mL RZ裂解液，充分混勻，在室溫下放置5 min。利用總RNA提取試劑盒提取樣本總RNA。比色杯測RNA濃度，用1 μg的RNA去逆轉錄，每12 μL體系中加入oligo (dT)151 μL，random 1 μL，dNTP(2.5 mMeach) 2 μL，5×Buffer 4 μL，RNasin 0.5 μL，M-MLV 1 μL，實驗樣品RNA 2 μL。逆轉錄反應條件：25℃溫浴10 min， 42℃溫浴50 min，95 ℃ 加熱5 min終止反應，將逆轉錄后的cDNA產物置于-20℃保存。

2.6 PCR反應

PCR反應體系， 2×Taq PCR Master-mix 10 μL，CDNA 1 μL，上游特異性引物1 μL，下游特異性引物1 μL，ddH2O補足至20 μL。β-actin引物序列：上游引物：5′GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TAG C3′，下游引物：5′GGC CGG ACT CAT CGT ACT CCT GCT T3′，β-actin擴增條件：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 20 s變性，60 ℃ 20 s退火，72 ℃ 延伸，4 ℃ 5 min終末延伸。30循環，4℃保溫。CGRP引物序列：上游引物：5′CAG GAG GAG GAA CAG GAG GCT3′，下游引物：5′CAG GTG CTC CAA CCC CAA T3′[8]，CGRP擴增條件：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 20 s變性，62 ℃ 20 s退火，72 ℃延伸，4 ℃ 5 min終末延伸。30循環，4℃保溫。

2.7 統計方法

3 結果

3.1 各組免疫抑制相關指標評價

針刺組大鼠體重、脾臟、胸腺指數及白細胞計數與模型組相比顯著增加，電針組大鼠體重、胸腺指數與模型組相比顯著增加，見表1。

3.2 各組穴區內CGRP表達比較

RT-PCR結果顯示：電針組和針刺組治療后，穴區CGRPmRNA表達量顯著下降，與模型組比較有顯著性差異；針刺組下降程度顯著高于電針組，兩組比較有顯著性差異。見圖1、表2。

圖1 針刺對“足三里”穴區CGRPmRNA表達的影響注：M：Marker;MJ：模型組；AJ：電針組；BJ：針刺組

組別體重(g)WBC(×103/ul)脾臟指數胸腺指數正常組300.41±62.5911.27±3.882.37±0. 762.15±0. 64假手術組287.19±59.2810.93±3.562.25±0. 581.93±0. 74模型組234.21±66.574.92±1.991.46±0. 621.18±0. 49電針組254.59±70.62*6.55±2.351.61±0. 601.57±0. 60*針刺組266.43±72.73*9.23±3.18**1.98±0. 73**1.8±0.005 6**

注:與模型組比較，**P<0.01，*P<0.05

表2 各組大鼠“足三里”穴區內CGRP表達情況比較

注:與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01;與電針組比較，▲P<0.05

4 討論

環磷酰胺是一種周期特異性烷化劑，主要作用于細胞周期的S期，影響DNA合成。其免疫抑制作用強而持久，能抑制體液免疫和細胞免疫反應[9]。本實驗用環磷酰胺制造免疫抑制大鼠模型，大鼠注射環磷酰胺后出現體重減輕、尿血、脫毛等免疫抑制癥狀。在本研究中，筆者用補法針刺免疫抑制大鼠足三里穴，結果顯示：針刺組大鼠體重、脾臟、胸腺指數及白細胞計數與模型組相比顯著增加，電針組大鼠體重、胸腺指數與模型組相比顯著增加。環磷酰胺具有骨髓抑制作用，可以導致粒細胞減少，針刺組與模型組相比大鼠白細胞計數顯著增加，而電針組與模型組相比大鼠白細胞計數雖然增加，但沒有統計學意義。胸腺屬于中樞免疫器官，脾臟屬于外周免疫器官，通過對大鼠脾臟指數與胸腺指數的檢測，可以考察針刺對免疫抑制大鼠免疫功能的影響。針刺組與模型組相比脾臟指數與胸腺指數均顯著增加，而電針組與模型組相比僅胸腺指數顯著增加?！鹅`樞經》云：“虛實之要，九針最妙，補瀉之時，以針為之”。傳統針灸的補法、次數與留針時間對疾病的療效具有重要影響。體現在本研究中，對于免疫抑制大鼠模型的治療效果，針刺組要優于電針組。

針刺起效的過程可分為局部進針，啟動針刺信息，信息沿復雜網絡途徑傳導，最后在靶器官發揮針刺效應等幾個環節。其中進針后啟動針刺信息為重要的始動環節。通過穴位進針，捻轉補瀉，引起穴位周邊微環境各種特異性應答變化，例如：交感腎上腺髓質系統的興奮，各種化學介質的釋放，不同細胞功能被激活等，最后作用于靶器官，引起靶器官針刺效應[10]。CGRP是感覺神經主要遞質，主要由背神經節合成，某些非神經細胞也可表達，如淋巴細胞和內皮細胞。CGRP具有重要的免疫調節作用，可調節多種免疫細胞功能，它可調節離體T淋巴細胞增殖和細胞毒作用，調節T淋巴細胞分泌IL-2和巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6 、IL-12、CXC趨化因子KC和巨噬細胞炎癥蛋白-2以及一氧化氮和前列腺素[11-12]。RT-PCR結果顯示：電針組和針刺組處理后，穴區CGRPmRNA表達量顯著下降，與模型組比較有顯著性差異；針刺組下降程度顯著高于電針組，兩組比較有顯著性差異，其原因可能為針刺局部的神經遞質CGRP與機體的皮膚樹突細胞相互作用，通過分泌相應的細胞因子，影響了T細胞的分化和功能，參與了機體的免疫過程。本研究使中醫傳統理論與現代醫學結合，豐富了神經-內分泌-免疫的研究內容，促進了針灸免疫學這一邊緣學科的發展，而CGRP對皮膚樹突細胞分化的影響及對機體T細胞應答方向的調控，將是今后研究的重點。

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