鼠神經生長因子穴位注射聯合通督調神針法對大鼠腦卒中后抑郁模型的影響

李善華，周 利，張 霞，李 莉

(1.十堰市太和醫院 湖北醫藥學院附屬醫院,湖北 十堰 442000；2.湖北醫藥學院，湖北 十堰 442000)

腦卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)屬繼發性抑郁癥，是腦卒中后恢復期最常見的神經系統并發癥，因其神經功能恢復延緩，患者常有情緒低落、興趣減退及睡眠障礙等臨床表現，且嚴重PSD者有自殺行為(或)傾向，因此，研究如何治療PSD具有重要意義[1]。研究表明，穴位注射鼠神經生長因子(Mouse nerve growth factor，mNGF)可起到營養神經、促進受損中樞神經元生長分化、恢復損傷神經功能的作用[2-3]。此外，大量臨床治療表明，在治療PSD時，運用通督調神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會等穴位可顯著改善PSD患者神經功能[4]。目前兩者在治療PSD時相互作用的機制還不太明確，本實驗采用膜片鉗技術記錄海馬CA1區自發性動作電位(Action potential，AP)和群峰電位(Population spike，PS)及與學習和記憶相關的神經遞質、相關蛋白，并結合行為測試來分析穴位注射mNGF聯合通督調神針法對PSD模型大鼠學習和記憶的影響，分析其治療PSD的機制，力圖在此類研究中有所突破，為臨床治療PSD提供實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選經曠場實驗(OPEN-FIELD)行為學評分篩選合格的健康雄性SD大鼠50只，體質量160～170 g，購自湖北醫藥學院動物中心，所有動物均于實驗前適應性飼養1 周。

1.1.2 實驗儀器和試劑 WMT-100型Morris水迷宮(成都泰盟)；鼠神經生長因子[舒泰神(北京)生物制藥股份有限公司，批號：017S20060023]；水合氯醛(武漢博菜特化工有限公司)；玻璃電極拉制儀(日本Narishige公司，型號：PP-83)；振動切片機(英國Campden公司，型號：752M)；膜片鉗放大器(英國Campden公司，型號：Mul-ticlamp700A)；S100B蛋白和神經絲蛋白(NFP)ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備和分組 大鼠PSD模型制備[5]：采用OPEN-FIELD篩選合格的健康雄性SD大鼠50只，將評分接近的40只造模。用10%水合氯醛(35 mg·kg-1)腹腔注射，待麻醉后俯臥位固定，剪去頸部皮膚,消毒，鋪無菌巾，切開頸部皮膚，分離左側頸內動脈，結扎左側頸內動脈(結扎時可在動脈平行放一6號半針頭，拉緊絲線，然后抽出針頭，這樣可使頸內動脈內徑縮小1/2)造成大鼠局灶性腦缺血。術后2 h以大鼠行走向對側倒體或行走轉圈、靜止時向對側前肢蜷曲、Zea Longa神經行為學評分為1～4分為納入標準，0和5分棄去[6]。納入的動物在術后1周內每天給予1次中等強度的慢性不可預見的溫和性應激刺激(Chronic unpredicta-ble mild stress，CUMS),共處理3周。CUMS刺激方法：每天選擇以下7種刺激中的一種(或按順序選擇其中的一種)，包括禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、45℃烤箱烘烤5 min、利用燈光使動物活動晝夜顛倒、4℃冰水游泳5 min、振蕩機高速水平振蕩30 min等7種刺激方法。以上應激刺激交替進行，刺激后將造模大鼠單獨飼養(孤養)。3周后再經過OPEN-FIELD行為學評分篩選成模大鼠進行分組和治療[7]。

分組：將以上應激孤養3周的造模大鼠再經過OPEN-FIELD行為學評分篩選，保留其中合格(成模)的PSD大鼠20只，隨機分為模型組(PSD組)和治療組,各10只，另10只正常SD大鼠作為正常組。正常組不造模，并且5只共養，不做CUMS處理。

1.2.2 治療方法 正常組和PSD組不做任何治療。治療組針刺取穴參照《實驗針灸學》，針刺取“神庭、水溝、大椎、百會”穴位[8]。針刺每日1次，每次25 min，運用“通督調神針法”，中間行針3次，針刺治療每周 6次為1個療程，治療 4 個療程。針刺后于以上諸穴注射mNGF，注射前參照動物用藥計算公式準確計算用藥劑量。將mNGF用注射用生理鹽水配制成0.1%溶液，按1 mg·kg-1穴位注射，間隔1天注射治療1次，共注射14天。

1.2.3 Zea Longa神經行為學評分方法 分6個等級，其中無功能障礙記0分；不能伸展前肢記1分；向一側旋轉記2分；向一側傾倒記3分；無自主活動伴意識抑制記4 分；死亡記5 分。

1.2.4 CA1區腦薄片的制備和膜片鉗技術 先配制人工腦脊液并通95%O2+5%CO2飽和，置于4℃冰箱備用。斷頭處死大鼠，咬去頂骨，迅速分離腦組織，放入4℃飽和人工腦脊液中修整分離出海馬CA1區組織，用振動切片機切片(厚約300～400 μm)。孵育1 h后進行膜片鉗技術記錄海馬CA1區自發性動作電位(Action potential，AP)和群峰電位(Population spike，PS)[9]。

1.2.5 免疫組化檢測 取CA1區海馬腦薄片，石蠟包埋，切片、烤干、脫蠟，用3%HO溶液沖洗10 s，滴一抗，4℃過夜，陰性對照滴加PBS溶液。隔日后室溫下復溫，滴二抗工作液，37℃孵育10 min，辣根酶標記10 min；用DAB顯色，蘇木素復染，然后分化、返藍、脫水、封片。腦薄片SP染色后乙酰膽堿(Ach)和神經絲蛋白(NFP)蛋白陽性為胞漿棕黃色或黃褐色。用圖像分析軟件統計各組平均光密度值(IOD)。在處死動物前取斷尾取0.2 mL尾靜脈血，采用免疫吸附法檢測靜脈血清乙酰膽堿脂酶(AChE)和S100B 蛋白含量[10]。

1.2.6 Morris水迷宮實驗 于治療結束后用WMT-100型Morris水迷宮分析系統中定位航行試驗和空間探索實驗以確定逃避潛伏期和60 s內穿越原平臺次數，結合Zea Langa神經行為學評分評定大鼠學習和記憶能力。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠海馬CA1區AP和PS膜電位電位值比較

正常組大鼠海馬CA1區AP膜電位電位值和PS記錄的膜電位均保持在正常范圍(61.32±4.69)mV。PSD組大鼠海馬CA1區AP和PS記錄的膜電位異常增高，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。治療組AP和PS記錄的膜電位明顯低于PSD組(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠海馬CA1區AP和PS膜電位電位值比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.2 大鼠海馬CA1區組織中Ach和NFP比較

PSD組大鼠CA1區組織中Ach和NFP含量降低，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)；治療組則明顯增多，與PSD組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠海馬CA1區組織中Ach和NFP比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.3 大鼠靜脈血清AChE和S100B蛋白含量比較

PSD組大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均增高，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。治療組大鼠血清AChE和S100B蛋白含量均降低，與PSD組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠靜脈血清AChE和S100B 蛋白含量比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

2.4 大鼠Morris水迷宮測試結果及Zea Longa神經行為學評分比較

PSD組大鼠定位航行試驗逃避潛伏期明顯升高，在空間探索試驗撤去平臺60 s中，PSD組跨越平臺次數減少，且大鼠Zea Longa神經行為學評分增大，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。而治療組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨越平臺次數明顯增多，且大鼠Zea Longa神經行為學評分較PSD組明顯降低，與PSD組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠Morris水迷宮測試結果及Zea Longa神經行為學評分比較

注：與正常組比較，1)P<0.05;與PSD組比較，2)P<0.05

3 討論

“PSD”屬中醫學郁證的“因病致郁”范疇，患者在腦神失常后又會出現五臟神紊亂現象，故其病位雖在腦，但隨病性加重而致心、肝、脾、肺、腎等五臟功能異常[11]。鼠神經生長因子(mNGF)是從小鼠頜下腺中提取的一類具有營養神經功能的蛋白，在動物實驗中發現其可促進神經功能恢復，改善己二酮或丙烯胺致小鼠中毒性周圍神經炎引起的運動障礙[12]。而針刺能起到安神定志、調理氣血、醒腦開竅的治療作用[13]。本實驗通過穴位直接注射mNGF，結合通督調神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會穴，觀察其對PSD模型大鼠學習記憶能力及行為學的影響。

觀察發現，治療組大鼠在干預性治療后，膜片鉗記錄顯示治療組AP和PS電位值明顯降低，免疫組化發現CA1區組織中Ach表達上調，靜脈血AChE降低，這可能是針刺產生的治療作用。有研究表明，針刺可糾正病灶產生的異常電活動，因PSD模型腦組織存在持續性缺血，這會導致持續Na通道開放，Na+內流增加，這樣細胞內Na+濃度持續增加引起神經細胞損傷，這也是PSD組大鼠海馬CA1區AP和PS記錄的膜電位異常增高的離子基礎。而針刺治療能促進持續開放的Na通道關閉，使Na+內流減少，細胞內外離子水平重新恢復平衡，防止細胞內鈣超載，使神經細胞功能得以逐漸恢復[14]。Ach是中樞釋放的神經遞質,其與大腦的學習、記憶功能密切相關，Ach對于維持意識的清醒及學習記憶起重要作用，而AchE可水解神經突觸Ach，降低中樞神經突觸Ach含量，造成學習和記憶力下降[15]。本實驗中治療組CA1區組織中Ach表達上調，靜脈血AChE降低，提示針刺可提高中樞膽堿能神經釋放神經遞質Ach，并抑制AChE釋放，使神經突觸Ach水解減少，這樣，中樞神經突觸Ach增多，膽堿能神經興奮性恢復，使PSD導致的學習記憶障礙得以改善。S100B蛋白主要分布于中樞神經系統中的室管膜細胞、星形膠質細胞和樹突膠質細胞，大量臨床檢測發現，PSD患者血清S100B蛋白濃度明顯提高，S100B蛋白增高可導致腦組織對缺血缺氧的敏感性，增加神經元損傷及衰亡的風險，而抗抑郁治療后則顯著下降，說明其濃度變化與病情嚴重程度呈正相關[16]。NFP主要分布于神經細胞胞體和神經突觸內，由神經元胞體合成，主要發揮維持神經元功能及軸漿運輸作用，可促進受損神經元的修復和再生以盡快恢復神經功能的作用[17]。治療組CA1區組織中NFP的表達上調，靜脈血S100B蛋白含量降低。提示穴位注射mNGF可促進神經細胞胞體和神經突觸內NFP的合成，修復受損神經元，同時抑制S100B蛋白合成，降低腦組織對缺血缺氧的敏感性，在一定程度降低神經元持續損傷的風險。治療組在以上綜合作用下，Morris水迷宮實驗顯示治療組定位航行實驗逃避潛伏期縮短，空間探索實驗跨越平臺次數明顯增多，Zea Langa評分提高，說明穴位注射mNGF聯合通督調神針法可改善PSD模型大鼠腦組織及神經系統所處的微環境，消除學習記憶障礙。

總之，在本實驗中，穴位注射mNGF可促進NFP的合成，修復受損神經元，同時抑制S100B蛋白合成，降低PSD后腦組織對缺血缺氧的敏感性，起到直接修復和保護受損神經元作用。而采用通督調神針法針刺神庭、水溝、大椎、百會等穴，一方面起到安神定志、醒腦開竅的作用，還可通過提高膽堿能神經突觸釋放Ach，抑制異常升高的膜電位，減輕神經功能損傷和退化，進而改善PSD大鼠學習和認知功能。

[1] 張丹，張春紅，馬會靖，等.中醫療法預防腦卒中后抑郁有效性的系統評價[J].中國中醫急癥，2017，26(4)：577-580，628.

[2] 吳瑞，董治燕，李海軍，等.鼠神經生長因子聯合依達拉奉治療腦出血的臨床效果及對神經功能的影響[J].中國醫藥導報，2017，14(5)：145-148.

[3] 李慧芳，劉向龍.注射用鼠神經生長因子治療視神經損傷2例分析[J].中國中醫急癥，2009，18(10)：1721.

[4] 宋書昌，盧智，王潤云，等.針刺辨證取穴法治療腦卒中后抑郁臨床研究[J].中國中醫急癥，2014，23(8)：1453-1454，1478.

[5] 劉福友，楊石，陳衛垠，等.腦卒中后抑郁大鼠模型的建立[J].中國臨床康復，2006，10(42)：91-94.

[6] 田會玲，李小黎，唐啟盛，等.頤腦解郁復方對卒中后抑郁大鼠行為學及海馬CA1區病理損傷的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2017，24(7)：49-53.

[7] 孫世光，王婧婧，李自發，等.曠場實驗：昆明小鼠行為學評價方法的重測信度檢驗[J].中華行為醫學與腦科學雜志，2010，25(12)：1093-1095.

[8] 李忠仁．實驗針灸學[M]．2版．北京：中國中醫藥出版社，2007：253-255.

[9] 徐祖才，陳恒勝，劉靚，等.膜片鉗技術在成年小鼠海馬腦片應用的初步研究[J].重慶醫科大學學報，2012，37(9)：799-801.

[10] 蘇淑杰，李志潔.鼠神經生長因子對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后神經修復的作用[J].中國實用神經疾病雜志2011，14(3)：15-17.

[11] 王永炎，張伯禮．中醫腦病學[M]．北京：人民衛生出版社，2007：321-325.

[12] 劉強，劉清君，魚濤，等.神經生長因子對2，5-己二酮中毒小鼠周圍神經損傷的治療作用[J].中國藥理學與毒理學雜志,2005，19(1)：39-43.

[13] 宋書昌，盧智，王潤云，等.針刺辨證取穴法治療腦卒中后抑郁臨床研究[J].中國中醫急癥，2014，23(8)：143-1454，1478.

[14] 任麗，王玉凱，方燕南，等.電針治療對大鼠腦缺血后電位門控型鈉通道Na(v)1.6表達的影響[J].中國腦血管病雜志，2010，7(12)：648-652.

[15] 劉玉峰，劉京華，張慶松，等.針刺結合綜合康復對腦癱患兒血清乙酰膽堿酯酶的影響[J].現代中西醫結合雜志，2011，20(23)：2927-2928.

[16] 常靜，沈仲夏，蔡敏.卒中后抑郁患者抗抑郁治療血清S100B蛋白的變化分析[J].醫學研究生學報，2016，29(7)：737-740.

[17] Laser-Azogui A，Komreich M，Malka-Gibor E，et al．Neurofilament assembly and function during neuronal development[J]．Curr Opin Cell Biol，2015(32)：92-101．