煤矸石堆對土壤微生物活性的影響研究

袁 敏，張啟來，霍永青

(1.天津市環境保護科學研究院，天津 300191；2.天津市武清區環境保護監測站，天津 301700；3.天津市聯合環保工程設計有限公司，天津 300191)

0 引 言

隨著世界人口的持續增加和經濟發展，某些地區生態環境正在不斷惡化，在這種形勢下，土壤質量受到人們的普遍關注[1]。目前，我國現有煤矸石山1 500多座，侵占土地約1.5×104km2，造成土地資源的浪費，煤矸石是我國產出量最大的工業固體廢棄物之一[2-3]。煤礦中含有的多種非中性物質以及微量重金屬等，通過淋溶、揚塵等方式進入土壤，再通過徑流、滲透等方式在土壤中擴散，造成一定區域內土壤酸、堿性的明顯改變，打破了土壤中重金屬的本底值和平衡關系，破壞植被適宜生長的環境，造成大量植物枯死，短期內很難恢復[4-6]。為了消除污染，自20世紀60年代起，國內外很多學者就煤矸石的污染問題展開了相關研究工作，探索煤矸石處理和利用的新方法[7-13]。

單家村煤礦是山東裕隆礦業集團有限公司的發源地和經濟支柱企業，位于山東省曲阜市時莊鎮境內，礦井南臨327國道1 km，東距曲阜市14 km，井田面積6.3 km2，煤質為低灰、低磷、特低硫2號氣煤。單家村煤礦自二十世紀七八十年代開始建設以來，煤矸石山堆積超過30年。煤矸石除含有粉塵、SiO2、A12O3、Fe、Mn等常量元素外，還有其他微量重金屬元素，如Pb、Sn、As、Cr等，這些元素為有毒重金屬元素。當露天堆放的煤矸石山經雨水淋蝕后，產生酸性水，污染周圍的土地和水體(因當時考慮的是監測周邊土壤污染狀況，所以煤矸石具體成分含量沒有分析)。

土壤微生物活性能夠簡單快速的鑒別出土壤質量的好壞，而土壤中重金屬含量對土壤微生物影響較大[14]。重金屬的污染均能降低細菌、真菌等的數量，能夠改變土壤微生物的新陳代謝[15-18]。重金屬污染在一定程度上也影響土壤生態系統氮循環[19]。有學者研究表明六價鉻污染對不同的土壤生化作用有不同的效應[20]。研究土壤微生物活性與重金屬含量的關系對于揭示地區土壤污染狀況和修復土壤重金屬污染具有重要意義。

本試驗從微生物活性角度入手，分析煤矸石堆造成土壤重金屬污染的生物機制。實驗采用原子吸收分光光度法測定距離矸石堆不同距離中土壤重金屬(Cr6+、Pb、Hg等)的含量，確定土壤污染程度；通過微生物培養確定周圍土壤中三種常見微生物(細菌、放線菌和霉菌)的活性，探討煤矸石堆對周圍土壤中微生物活性產生的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

土樣采自曲阜市單家村裕隆煤礦煤矸石堆附近，以煤矸石堆為中心，分別在距矸石堆0 m、10 m、50 m、80 m、125 m的圓周上采樣(圖1)。每個圓周均設10個采樣點，采樣深度為土壤表層0～20 cm。取回土樣，將同距離、不同方位采樣點處的樣品混合，將土塊壓碎，除去石塊、植物殘根等雜物，將土壤鋪成薄層，在陰涼處自然風干。風干后的土樣用陶瓷研碎后，過篩(篩孔直徑2 mm)，除去2 mm以上的砂礫和植物殘根，用四分法反復多次棄去多余樣品，用瑪瑙研缽繼續研細，然后過-0.025 mm篩，充分混勻后備用[21]。

1.2 實驗方法

1.2.1 重金屬含量的測定

土壤樣品采用硝酸-鹽酸-高氯酸分解體系法分解。稱取0.5 g(準確到0.1 mg)風干土樣于50 mL燒杯中，再用少量去離子水濕潤，加硝基鹽酸5 mL，加熱保持微沸至有機物劇烈反應后，加高氯酸1 mL繼續加熱至樣品分解呈灰白色，再用0.12 mol/L的硝酸溶解。待溶液冷卻后用50 mL容量瓶定容，再過濾一兩次，得澄清透明溶液，轉移至聚乙烯塑料瓶中保存待測。

取適量土壤消解液，用原子吸收分光光度計測量其中的重金屬(Cr6+、Pb、Hg等)含量[22]，與土壤背景值對照。

1.2.2 土壤微生物(細菌、放線菌、霉菌)的培養

土壤微生物(細菌、放線菌、霉菌)的培養與分離見表1[23]。

圖1 采樣點分布

樣品來源分離對象分離方法稀釋度培養基培養溫度/℃培養時間/d土樣細菌稀釋分離10-6牛肉膏蛋白胨30～371～2土樣放線菌稀釋分離10-3高氏一號285～7土樣霉菌稀釋分離10-3馬丁氏28～303～5

2 結果與分析

2.1 土壤樣品理化性質

根據土樣的采集情況和相關文獻，土壤樣品的理化性質具體包括土壤的pH值、含水率、土壤有機質、陽離子交換量、重金屬總量、重金屬有效態等，具體見表2。

在研究重金屬對土壤微生物生長代謝的過程中，對其起主要影響作用的是重金屬的有效態形式，因此以重金屬有效態為研究對象。

2.2 土壤重金屬有效態量隨距離變化分析

從圖2可以看出，土壤中重金屬汞的有效態含量隨距離煤矸石山距離的增大先下降較為迅速，從50 m以后下降緩慢。w(Hg)的最高值達到1.08 mg/kg。用GB15618—1995中土壤二級環境質量標準值(Hg≤0.3 mg/kg)作為參照值，可發現前兩個采樣點土壤汞含量已超過此背景值，可見此處土壤已受到較嚴重的汞污染。可能與重金屬汞在土壤中遷移能力或周圍土壤環境及其種植的植物有關。

表2 供試土壤的理化性質

圖2 土壤中重金屬隨距離變化

對于鉛含量，總體來講隨距煤矸石山距離的增大呈下降趨勢。但是在0～10 m內下降趨勢明顯，10 m后隨距離增大鉛含量基本維持在50 mg/kg左右。用GB15618—1995中土壤二級環境質量標準值(Pb≤ 250 mg/kg)作為參照值，可見此處土壤中鉛含量并沒有超過這一值，可能與煤礦開采較晚以及當地氣候或土壤環境有關。

土壤中Cr6+含量隨距離煤矸石山距離的增大呈下降趨勢。距離煤矸石125 m處土壤中Cr6+含量與0 m處相比約減少了6.49倍。用GB15618—1995中土壤二級環境質量標準值(Cr6+≤0.3 mg/kg)作為參照值，可以發現前四個采樣點土壤Cr6+含量已超過此背景值，可見此處土壤已受到較嚴重的Cr6+污染。土壤中Cr6+含量的分布是礦渣內細小顆粒物隨風遷移的結果，在風向和風速一定的情況下，主要受距離矸石山遠近的影響[24]：距離矸石山愈近，礦渣堆內的細小顆粒物在隨風遷移時在此部位沉積的就愈多，而礦渣內細小顆粒物中Cr6+含量較高，Cr6+在此部位的富集就愈多，土壤中Cr6+含量也就增加的愈多；距離矸石山愈遠，礦渣內的細小顆粒物沉積的就愈少，土壤中Cr6+含量的增加也就愈少。

2.3 土壤微生物含量分析

土壤中的菌類數量變化見圖3。

2.4 重金屬復合污染對細菌、放線菌、霉菌生長影響的相關回歸分析

從圖3菌類數量變化可以看出，各采樣點處細菌菌落數均低于對照點，在其他影響因素不變的情況下，細菌對重金屬的敏感性最強，對細菌的生長產生抑制作用，使得細菌不能正常生長[25-27]。由回歸方程Y=12.5+0.165X1+0.621X2-0.085X3及方差分析表3可以看出，土壤重金屬有效態含量對細菌數量的變化產生了顯著影響，三種重金屬中，Pb是影響細菌含量變化的主要因素，Pb含量每變化一個單位，細菌數量平均變化0.621個單位。并且，在重金屬對細菌生長產生抑制作用的情況下，Pb與細菌數量基本呈現正相關關系(圖4)，是由于采樣點處土壤理化性質不符合細菌生長所需最適環境(如最適pH值為6.5～7.5)造成的。有研究表明：重金屬Pb對土壤酶具有明顯的抑制作用[26]。重金屬破壞了土壤酶活性從而導致微生物生存環境惡劣，細菌數明顯呈下降趨勢。

圖3 菌類數量變化圖

變異來源平方和自由度均方F回歸96.654332.21820.681??剩余68.546441.558總和165.20047

注：F3，44，0.01=4.331，F> F3，44，0.01,差異極顯著。

由回歸方程Y=26.485+0.068X1-0.624X2-0.818X3和方差分析表4可以看出，土壤重金屬有效態含量對放線菌數量的變化產生了顯著影響，超過了1%的極顯著水平，反映了土壤中重金屬的積累，特別是Pb和Hg，對放線菌的負面制約作用。由圖5放線菌受Pb和Hg影響曲線圖(Hg的含量較低，為方便起見，作圖時放大10倍)可看出，0 m由于“邊際效應”，放線菌數與重金屬有效態含量呈現正相關趨勢；除0 m以外，其他采樣點處Hg與放線菌變化呈現負相關關系。原因可能是微生物對不同金屬毒性的敏感性差異，高濃度的重金屬會導致微生物抗逆性增強，引起種群數量變化，從而降低微生物數量；低濃度的重金屬可以促進土壤微生物的生長和繁殖，從而提高微生物數量，這與韓桂琪等[16]的研究結果相似。因此，重金屬Hg是影響放線菌數量變化的主要重金屬元素。

圖4 細菌受鉛含量變化圖

變異來源平方和自由度均方F回歸10.63833.5464.182??剩余116.1621370.848總和126.800140

注：F3。137，0.01=3.011，F> F3，137，0.01，差異極顯著。

圖5 放線菌受Hg、Pb影響變化曲線圖

由回歸方程Y=17.905-0.099X1-6.55X2-2.456X3和方差分析表5可以看出，土壤重金屬有效態含量對霉菌數量的變化產生了顯著影響，顯著性水平達99%以上。由圖6霉菌受Hg和Pb影響曲線圖(Hg的含量較低，為方便起見，作圖時放大10倍)可以看出，Hg與霉菌變化呈明顯負相關關系，是由于高濃度的重金屬破壞了霉菌的生存環境，抑制了霉菌正常新城代謝，影響霉菌的正常生長；10 m之后Hg的濃度明顯降低，霉菌數量顯著增加，而后逐漸趨于穩定。原因可能是土壤環境在重金屬的脅迫下，土壤微生物群體組成或結構發生了一定的變化，而低濃度的重金屬對土壤環境影響較小，霉菌對重金屬的耐性增強，其對霉菌的抑制作用減弱，使得霉菌數量相對有所增加，這與向彬等[26]的研究結果類似。因此，Hg為影響霉菌數量變化的主要重金屬元素。

表5 重金屬對霉菌影響的正交試驗方差分析表

注：F3，69，0.01=4.099，F> F3，69，0.01，差異極顯著。

圖6 霉菌受Hg、Pb影響變化曲線圖

3 結 論

1) 在煤矸石污染源的作用下，土壤中重金屬Pb和Hg的含量全部超出《土壤環境質量標準》(GB15618—1995)中的一級標準，重金屬Hg在0 m和10 m處的含量甚至超出二級標準的要求。其中，w(Pb)的最高值達到114.247 mg/kg，大大超過GB15618—1995中的一級標準(35 mg/kg)；w(Hg)的最高值達到1.08 mg/kg。

2) 鉛在土壤中的含量在0 ～10 m處下降明顯，但高于土壤二級環境質量標準值。隨距離煤矸石山距離的增大，土壤中Cr6+含量急劇下降。土壤中的鉛、鉻進入土壤后主要和土壤中的碳酸鹽、有機質和氧化物結合，受土壤pH值等影響。

3) 在煤矸石堆的影響下，土壤中重金屬(Cr6+、Pb、Hg)對土壤微生物(細菌、放線菌、霉菌)產生影響。隨著重金屬含量的降低，土壤微生物受其影響程度減弱。由相關回歸分析可見，在99%置信區間下計算所得的F值均大于臨界值，說明這三種重金屬對微生物的影響極顯著。Pb對細菌的影響最為顯著，而Cr6+和Hg對其影響較弱；放線菌同時受Pb和Hg兩種重金屬的影響，其中Hg對其影響最為顯著；Hg、Pb較之Cr6+對霉菌的影響更為顯著，而且Hg有效態含量與霉菌數量變化成明顯負相關關系。

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